B亚型禽偏肺病毒重组G蛋白间接ELISA方法的建立及应用

以纯化的B亚型禽偏肺病毒(aMPV)疫苗株(VIR-115 B)重组G蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立检测B亚型aMPV抗体的间接ELISA方法.将构建好的重组质粒转入Rosetta (DE3)感受态细胞进行诱导表达,获得重组G蛋白.利用亲和层析法对表达产物进行纯化,并用Western-blotting对表达产物进行鉴定.以纯化后的重组G蛋白作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测B亚型aMPV抗体的间接ELISA诊断方法.结果显示,成功表达并纯化了B亚型aMPV疫苗株(VIR-115 B)重组G蛋白,Westernblotting检测结果证明表达产物具有良好的反应原性.以重组G蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法.交叉试验结果表明重组G蛋白与新城疫、禽流感(H9N2)、传染性支气管炎和传染性法氏囊阳性血清均不发生交叉反应.该方法与法国IDEXX公司生产的aMPV抗体检测试剂盒符合率为96.0％.采用本试验建立的间接ELISA方法对山东省7个地区鸡场的1 139份鸡血清进行了检测,结果表明,山东省部分地区aMPV的抗体阳性率为37.05％.本试验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,利用该方法初步证实山东省部分地区存在aMPV感染现象.这一研究为aMPV诊断试剂盒的研制奠定了基础,并为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段.     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

IBDV VP2蛋白在果蝇S2细胞中的表达与抗原性分析

利用果蝇S2细胞表达鸡传染性囊病病毒(IBDV)超强毒株VP2蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增IBDV VP2蛋白的编码基因,与果蝇S2细胞表达载体pMT/BiP/V5/HisA连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5/HisA-VP2,将重组表达载体与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,表达VP2融合蛋白后纯化目的蛋白,并对表达产物进行抗原性分析。Western-blotting分析表明,融合蛋白相对分子质量为49 kDa,该融合蛋白具有与VP2单抗良好的结合能力。结论 IBDV VP2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行有效地表达,并且能分泌到上清中,融合蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断抗原用于该病的诊断检测。     

猪圆环病毒2型结构蛋白Cap在果蝇S2细胞中稳定表达与鉴定的研究

为了表达猪圆环病毒2型(PCV-2)结构蛋白Cap并检测其表达情况,试验采用果蝇S2细胞真核表达的方法,通过扩增PCV-2 Cap蛋白的编码基因,与昆虫细胞表达载体pMT/Bip/V5-HisA连接构建重组表达载体pMT/Bip/V5-HisA-Cap,用重组表达载体与筛选质粒pCoHygro共转染S2细胞,再使用选择性培养基加压筛选出稳定的细胞株,表达Cap融合蛋白后,利用SDS-PAGE及Western-bolt研究表达产物的抗原性。结果表明:融合蛋白的分子质量约为31 ku,该蛋白能够与带有V5标签的抗体结合,说明PCV-2 Cap蛋白能在S2细胞中正确表达,并具有良好的抗原性。     

大肠杆菌F18ac菌毛FedA蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的F18ac菌毛A亚单位的基因序列(FedA)设计一对引物,利用PCR技术从重组质粒T 8813A 中扩增到一段序列,并按预定的阅读框插入表达性质粒载体pGEX 6p 1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedA/ac,并转化大肠杆菌BL 21 获得重组菌PPFedA/ac。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该序列大小为456 bp,与已发表的FedA/ac结构编码序列完全一致。通过对菌体裂解物的SDS PAGE 分析以及Western blotting 鉴定,证明重组大肠杆菌PP FedA/ac的可以表达融合蛋白形式的FedA/ac (命名为GST FedA/ac),即FedA/ac蛋白(15.317 ku)与谷胱苷肽转移酶(27.335 ku)相连组成分子量为42.652 ku的融合蛋白。利用GST FedA/ac制备的兔抗GST FedA/ac 血清与大肠杆菌F107/86 株( F18ab )、2 134 P 株(F18ac )进行的玻板凝集试验呈现阳性反应,进一步表明了表达的正确性。     

共表达基因Ⅱ型新城疫病毒F、HN蛋白mcDNA载体的构建

为了构建共表达基因Ⅱ型新城疫病毒(NDV)F、HN蛋白的mcDNA载体,试验采用融合PCR技术将合成的Ⅱ型NDV的F基因片段与HN基因片段融合并携带Flag标签,构建pUC-F-HN-Flag基因片段,然后与mcDNA载体MN512A连接构建重组质粒MN512A-pUC-F-HN-opt-Flag,采用菌落PCR扩增与酶切方法对重组质粒进行鉴定;利用阿拉伯糖诱导剂诱导重组质粒产生mcDNA;将重组质粒转染至HEK-293T细胞中,收集细胞总蛋白并通过Western-blot与间接免疫荧光试验检测蛋白表达情况。结果表明:通过F、HN基因片段的扩增与融合成功构建pUC-F-HN-Flag基因片段,菌落PCR扩增与酶切结果证明重组质粒连接成功,经诱导剂诱导重组质粒成功产生mcDNA,Western-blot及间接免疫荧光试验均检测到目的蛋白。说明重组质粒MN512A-pUC-F-HN-opt-Flag构建成功。     

犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定

为表达具有天然构象的犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因,克隆至pFastBacTM1载体中,测序验证后转化至DH10BacTM感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H,将其分别转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB-F、rpFB-H,并将表达的重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)进行IFA和Western blot鉴定。以犬抗CDV高免血清对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,在感染细胞的细胞膜上可见特异性荧光反应;以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体对重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测,可见相对分子质量为63和68ku左右的条带,分别为重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH),大小与预期相符。两种囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中均成功表达,且具有良好的反应原性。本研究为CDV病毒样颗粒疫苗的开发等工作奠定了基础。     

基于狂犬病病毒重组蛋白的ELISA检测方法比较研究

原核表达狂犬病病毒的基质蛋白(M),并以此作为包被抗原建立间接ELISA检测方法,与以狂犬病病毒磷蛋白(P)作为包被抗原建立的间接ELISA方法进行比较。根据GenBank中公布的狂犬病病毒LEP-Flury株M基因序列设计特异性引物并引入SmaⅠ和NotⅠ酶切位点,经RT-PCR扩增得到目的基因,连接pCR 2.1载体,构建重组质粒pCR-RV-M,重组质粒用SmaⅠ和NotⅠ进行双酶切,酶切产物定向克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-RV-M。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表明蛋白表达量较大,且主要以可溶性的形式表达。亲和层析纯化目的蛋白,Westernblot表明融合蛋白具有良好的反应原性,使用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法并检测了95份血清,同时使用带有His标签的重组狂犬病病毒磷蛋白P(RV-His-P)建立的ELISA方法和商品化的ELISA试剂盒检测该血清。结果表明:与商品化的以全病毒作为包被抗原的ELISA检测试剂盒相比,使用重组P蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测方法具有更高的符合率,能够代替全病毒作为诊断抗原建立检测方法。     

鹅源新城疫病毒F基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

参照GenBank公布的鹅源新城疫病毒NA-1株F基因(DQ659677)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增F基因全长,将其克隆到pET-22b( )载体中,构建了原核表达载体pET-22b( )-F,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化了重组蛋白,Western-blot证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为0.21μg/孔,建立了检测鹅源新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。     

口蹄疫3A蛋白基因的表达及其抗原性研究

从pUCm-3ABC质粒切割FMDV的3A蛋白基因DNA，将其与pET-30c( )载体连接，构建pET30C3A原核重组表达质粒，序列分析表明，pET30C3A重组质粒的插入3A蛋白基因的阅读框架正确。pET30C3A—BL21经IPTG诱导后可表达3A融合蛋白。Westem Blot试验证明该表达蛋白具有较好的抗原活性，提示可进一步用重组表达的FMDV 3A蛋白作抗原检测FMD。