猪源链球菌对环丙沙星耐药性与耐药基因突变的相关性研究

通过微量稀释法测定28株猪源链球菌对环丙沙星的MIC值,研究东北地区猪源链球菌对环丙沙星耐药性与parC、gyrA基因突变的相关性.通过PCR方法扩增parC和gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)并测序分析;18株耐药菌在parC基因80位的突变(AGC→ATT)导致氨基酸Ser→Ile突变,11株高度耐药菌在gyrA基因81位的突变(CAG→)CAT、CTT或CTA)导致氨基酸Ser→Ile、Phe或Tyr的突变.当菌株对环丙沙星的MIC值≤1μ/mL时,parC和gyrA基因的QRDR区均未有突变;而当MIC ≥2μg/mL时,ParC的氨基酸发生了Ser80→Ile的突变,同时发生GyrA氨基酸Ser81突变的菌株,耐药水平很高.研究表明,环丙沙星低水平类耐药是由于拓扑异构酶Ⅳ改变引起,而高水平耐药是由拓扑异构酶Ⅳ、DNA旋转酶共同改变引起的.实验结果证明,在一定条件下,耐药性的高低与突变位点的多少成正比.     

嗜水气单胞菌gyrA氟喹诺酮抗性决定区的克隆与分析

研究了从病鱼体内分离的嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药性的分子机理。以4株对诺氟沙星等氟喹诺酮类药物耐药菌株及2株敏感菌株为模板，参照杀鲑气单胞菌gyrA基因序列，设计了1对引物，进行gyrA基因氟喹诺酮抗性决定区PCR扩增，将扩增产物克隆入pMD18-T载体，转化入大肠埃希氏菌DH5α中，小提质粒，酶切鉴定，测序并分析比较耐药菌和敏感菌的氨基酸残基序列。发现耐药菌有5个氨基酸突变位点，分别是83位点的Ser→Ile,92位点的Leu→Met,174位点的Ile→Phe,202位点的Asn→Asp,203位点的Leu→Arg，耐药菌突变后的氨基酸残基均比敏感菌正常的相对应氨基酸残基分子量大。83位点的突变与大肠埃希氏菌的耐药性突变一致。122位点具有保守的Try。     

鸡源性沙门氏菌DNA旋转酶与耐氟喹诺酮类药物关系研究

取临床分离的、对5种氟喹诺酮类药物（环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星和沙拉沙星）均耐药的9株鸡源性沙门氏菌耐药株,提取其染色体DNA。设计引物gyrAF和gyrAR、gyrBF和gyrBR,分别扩增菌株DNA旋转酶gyrA基因和gyrB基因的氟喹诺酮类耐药决定区（QRDR）,对PCR扩增产物进行测序及序列分析。与质控菌株相比,9株临床分离耐药株中只有菌株38和60的gyrA基因发生单碱基突变,菌株38的gyrA基因第371位碱基发生C→T突变,菌株60的gyrA基因第350位碱基发生A→C突变,两处突变均位于QRDR内,其余菌株的核苷酸未发生任何突变。菌株38的碱基突变导致gyrA基因第99位氨基酸发生R→C取代,即Arg→Cys;菌株60的碱基突变导致gyrA基因第92位氨基酸发生M→L取代,即Met→Leu。9株临床分离鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株gyrB基因QRDR的核苷酸序列与质控菌株完全相同;只有菌株42的gyrB基因第1592位碱基发生C→A突变,但其位于gyrB基因QRDR之外,且菌株42的gyrB基因的碱基突变并没有导致相应氨基酸的改变。上述结果提示,DNA旋转酶gyrA基因和gyrB基因QRDR突变可能并非沙门氏菌耐药性产生的主要原因。     

猪链球菌对氟喹诺酮类药物的耐药性与靶位突变相关性

旨在了解猪链球菌对氟喹诺酮类药物耐药性与parC、gyrA基因突变的相关性,通过微量稀释法测定34株猪链球菌对4种氟喹诺酮类药物的MIC值,采用PCR方法扩增并测序分析了临床分离的猪链球菌对氟唪诺酮类约物10株耐药株和9株敏感株的parC和gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDRs).在氟喹诺酮类药物耐药菌株parC基因QRDRs发生Ser79→Phe、Arg 87→Leu的氨基酸突变,在4株高度耐药菌株gyrA基因QRDRs发生Arg66→Ser,Ser81→Arg氨基酸突变;当菌株对氟喹诺酮类药物敏感时,parC和gyrA基因的QRDR区均未有突变;而当MIC≥32 μg·L-1 时,parC的氨基酸发生了 Ser79→Phe的突变,同时发生gyrA氨基酸Arg66→Ser,Set81→Arg突变.结果表明,猪链球菌对氟喹诺酮类药物低水平类耐药是由parC单一位点突变引起,而高水平耐药是由parC和gyrA双位点突变引起.     

耐氟喹诺酮类药物鸡毒支原体DNA回旋酶及拓扑异构酶Ⅳ的突变特征

采用二倍稀释法测定临床分离的4株鸡毒支原体对常用抗菌药物的敏感性,PCR方法和基因测序法对鸡毒支原体DNA回旋酶编码基因gyrA、gyrB及拓扑异构酶Ⅳ编码基因parC和parE耐药决定区进行分析。敏感性测定结果表明,4株分离鸡毒支原体对泰乐菌素、泰妙林、沃尼妙林和替米考星有很高的敏感性,对四环素和红霉素中度敏感,对林可霉素、氟苯尼考和氟喹诺酮类药物呈现不同程度的耐药性。4株耐氟喹诺酮类药物鸡毒支原体均在GyrA和ParC的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)发生氨基酸的改变,GyrA的氨基酸取代模式有两种,分别为Ser81→Gly和Ser83→Ile,ParC仅在80位发生氨基酸取代(Ser80→Leu),GyrB和ParE均未发生氨基酸改变。     

福氏志贺菌gyrA和parC基因QRDR序列的测定和同源性分析

测定了我国痢疾流行病原志贺菌福氏2a 301株与喹喏酮类药物耐药性相关的gyrA(DNA旋转酶A亚单位）和parC（拓扑异构酶IVA亚单位）基因，并将gyrA和parC基因QRDR（喹喏酮类药物耐药性决定区）核苷酸序列与几种动物和人的病原菌进行了同源性和遗传进化比较分析，结果显示，志贺菌福氏2a gyrA和parC基因QRDR序旬分别与宋内氏志贺菌菌、大肠杆菌O157、大肠杆菌K12、阴沟肠杆菌、坂口肠道杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、坂口肠道杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副作寒沙门氏菌，肺炎克氏杆菌、产道氏杆菌、副伤寒沙门氏菌、肺炎克氏杆菌、产道克氏杆菌、空肠弯曲杆菌、沸氏柠檬酸杆菌具有显著同源性（均大于88％），表明gyrA和parC是这些细菌中的看家基因，推测在各种细菌中具有类似的起源，因此，对在不同细菌之间进行喹喏酮类药物耐药性的研究非常有利。QRDR的遗传进化分析表明，同属或相近属细菌gyrA或parC QRDR的遗传距离明显接近，其中与大肠杆菌属的距离最近，认为可列到同一个性中，结果有力支持了近年提出的大肠杆菌与志贺菌属于同族细菌的理论，研究对理解喹喏酮类药物耐药性的分子机理及其与细菌遗传进货之间的关系具有重要意义。     

动物源耐氟喹诺酮类药物致病性大肠杆菌gyrA基因的突变研究

用微量稀释法测定盐酸环丙沙星等5种氟喹诺酮类抗菌药物对20株耐氟喹诺酮类药物的动物源致病性大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC),PCR扩增gyrA基因的喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance determining regions,QRDR),扩增的片断长度为496 bp,PCR产物直接测序,用DNAStar软件分析氨基酸序列。结果显示,盐酸环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星和烟酸诺氟沙星的MIC范围分别为64～>512μg/mL、16～256μg/mL、16～128μg/mL、64～>512μg/mL和64～>512μg/mL。gyrA基因的突变位点均位于83和87位氨基酸位点,主要的变异方式为Ser83→Leu(15/20),其次是Asp87→Asn(13/20),其他的为Asp87→Tyr(6/20),Ser83→Trp(4/20),Ser83→Ala(1/20)和Asp87→Gly(1/20)。说明试验用菌株对氟喹诺酮类药物均表现为多重耐药,其gyrA基因QRDR的突变表现为多种形式。     

猪链球菌2型对氟喹诺酮类抗菌药耐药机制的初步研究

为研究猪链球菌2型(S.suis2)对氟喹诺酮类药物的耐药机制,本研究采用PCR和基因测序的方法分析氟喹诺酮类药物耐药诱导菌株的gyrA和parC喹诺酮耐药决定区(QRDR).与亲本药物敏感菌株和自然耐药菌株相应的氨基酸序列对比,所有耐药诱导菌株GyrA QRDR均无特征性的氨基酸变异;而有62.5％耐药诱导菌株(5/8)的ParC QRDR在第83位氨基酸突变为赖氨酸.应用质子能驱动型外排泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)与氟喹诺酮类药物联合用药后,CCCP可以使耐药诱导菌株对药物的敏感性提高8倍～32倍.交叉耐药性结果显示,耐药诱导菌株获得了氟喹诺酮类药物交叉耐药.     

鸭源鸡杆菌的药物敏感性及其对氟喹诺酮类药物的耐药机制

为了解近年来鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)的药物敏感性及其对氟喹诺酮类药物的耐药机制，以204株G.anatis为对象，选取11种抗菌药，用纸片法检测其药物敏感性，随后从中随机选取30株进行gyrA、parC基因的PCR扩增和测序，并分析喹诺酮耐药决定区编码氨基酸的突变情况。结果显示，试验菌株对复方新诺明、四环素、氟喹诺酮类药物的耐药率达86.76%以上，对头孢曲松与头孢噻肟的耐药率较低，分别为11.27%和7.35%;99.02%的菌株耐3种以上药物，92.16%的菌株耐6种以上药物，其中有6株对11种药物全部耐药；30株G.anatis全部扩增出parC基因，其中22株扩增出gyrA基因，GyrA亚基存在Ser83→Phe、Asp87→Ala/Tyr/Asn和Asp139→Tyr 3个位点氨基酸置换，ParC亚基存在Thr84→Ile、Glu88→Gly、Ala94→Val和Gly179→Val 4个位点氨基酸置换，敏感菌株不存在氨基酸位点突变，中度敏感菌株发生了3处氨基酸的替换，94.7%的耐药菌株发生了4处及以上氨基酸位点的置换。结果表明，G.anat...     

圈养虎源大肠杆菌QRDR基因检测及分析

为了解大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制和喹诺酮耐药决定区GyrA、GyrB、ParC、ParE四种基因的流行情况,采用聚合酶链式反应(PCR)技术对30株虎源大肠杆菌的耐药菌株进行了氟喹诺酮类药物耐药基因的检测,并对目的片段进行测序分析。结果表明:GyrA、GyrB、ParC、ParE阳性率分别为40.00%、63.33%、63.33%、40.00%;GyrA亚基发生Ser83→Leu、Asp87→Asn、Glu214→Gly的突变,GyrB亚基发生Ser195→Asn的突变,ParC亚基上氨基酸未发生取代,ParE亚基发生Ser85→Ala的突变。说明GyrA、GyrB亚基上发生的氨基酸替代是耐药菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性的主要机制之一。     

耐氟喹诺酮类药物鸡源大肠杆菌gyrA基因QRDR的突变检测

用微量肉汤稀释法对180株鸡源大肠杆菌临床分离株进行了6种氟喹诺酮类药物的耐药性监测，大多数分离株对氟喹诺酮类药物表现出高耐药率（52．9％～93．30%）并呈多重耐药性。提取各菌株染色体DNA，对gyrA基因QRDR进行PCR扩增并测序。氨基序列分析结果显示：168株耐药菌株的第83位的氨基酸均发生了变异，由丝氨酸（S）变为亮氨酸（L）；对4种以上氟喹诺酮类药物有耐药性的107株分离株除第83位氨基酸发变异外，第87位氨基酸也发生了变异，88株由天冬氨酸（D）变为天冬酰氨（N），13株为酪氨酸（Y），5株变为甘氨酸（G），1株变为丙氨酸（A），由此表明鸡源大肠杆菌对氟喹诺类药物的耐药程度与gyrA基因QRDR的变异密切相关，第83位氨基酸变异是大肠杆菌现对氟喹诺酮类药物耐药的关键。     

耐氟喹诺酮类药物禽源大肠埃希菌gyrA基因的检测分析

探讨不同禽源大肠埃希菌中喹诺酮类药物的耐药情况及耐药基因gyrA的分布和突变特征。采用K-B药敏纸片法、gyrA基因的PCR扩增,对9株大肠埃希菌进行喹诺酮类药物试验,并将gyrA基因的PCR产物测序,对测序结果采用DNA MAN、DNA Star、MEGA6等软件分析。药敏试验结果表明,C1、C2、C3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星敏感,D1、D2、D3、B1、B2和B3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星均表现为耐药和中介;gyrA基因的测序结果表明,除B1菌株有1处核苷酸突变位点和B2菌株有14处核苷酸突变位点;B2菌株gyrA基因的氨基酸突变发生在87位Ile→Val替代、101位Leu→Met替代、102位Ala→Ser替代、129位Lys→Gln替代。9株禽源大肠埃希菌的同源性和进化树分析表明,不同禽源耐氟喹诺酮类药物的大肠埃希菌菌株中B2菌株gyrA基因与其他9株菌株相比,同源性在90%左右,进化树不在一个分支上,研究中的B2菌株将为大肠埃希菌的氟喹诺酮类耐药机制的研究提供候选菌株。     

15株临床分离耐药大肠杆菌耐氟喹诺酮类抗生素基因的检测与序列分析

15株动物源性耐氟喹诺酮类药物大肠杆菌进行PCR检测、测序、WDNASIS软件分析gyrA基因中的氟喹诺酮耐药决定区(QRDR)、AcrA以及编码与质粒介导的氟喹诺酮类药物耐药机制相关的qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因。结果表明,15株耐药菌中,QRDR基因在其编码第72、75、83位或第87位氨基酸均发生突变;AcrA基因未检测到氨基酸的突变;qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr耐药基因阳性菌各检测到1株,序列分析表明不存在氨基酸突变。QRDR基因编码的氨基酸4个位点发生突变,其中Ser83→Leu和Asp87→Asn 2个基因的突变均与文献报道的突变相同,双突变的7个菌株均表现为高度耐氟喹诺酮类抗生素,表明gyrA基因为大肠杆菌耐氟喹诺酮类抗生素的一个重要机制。高度耐氟喹诺酮类抗生素的菌株中有2株没有检测到氨基酸突变的存在,但是aac-(6′)-Ib-cr基因和qnrS检测为阳性,表明质粒介导的喹诺酮类耐药也可单独导致菌株的耐药。存有一个菌株gyrA基因编码的氨基酸发生突变Ser83→Leu,AcrA基因和qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′...     

临床分离大肠杆菌对氟喹诺酮类药物高耐药株AcrA的过量表达

大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性通常由靶位酶DNA旋转酶和拓扑异构酶IV基因gyrA和parC突变介导，但是否基因突变单独就能介导高水平的耐药还不十分清楚。因为大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药还存在主动外排系统——AcrAB—TolC介导的耐药。Everett等检测了36株对环丙沙星高水平耐药的大肠杆菌，发现所有菌株都存在gyrA的突变，     

鸡和人志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药的关系

通过药敏实验检测了鸡鲍氏、人鲍氏和人福氏三株志贺菌对12种常用抗生素的耐药情况,发现三者均未产生对喹诺酮类药物的耐药性。用聚合酶链反应(PCR)分别扩增三株志贺菌的DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因,并对其中的耐喹诺酮类决定区(QRDR)进行了分析。发现鸡和人鲍氏志贺菌QRDR区的序列没有发生任何碱基突变,这与药敏试验结果相吻合。人福氏志贺菌虽然也对喹诺酮类无耐药性,但其gyrA基因存在83位Ser83(TCG)→Leu(TTG)的突变,由于只有83位点一处突变,所以尚未表现出耐药性表征,parC基因中存在58位Ser58(AGC)→Ile(ATC)的突变,该突变点与常见的80、84位氯基酸的改变有所不同,却仍在QRDR区域之中,虽然暂时还无法根据这一结果判断该突变与喹诺酮类耐药性之间的关系,但至少表明该菌株正处在耐药性演变进程之中,其在志贺菌耐药性中的确切作用还有待进一步研究。     

鸭疫里默氏菌的gyrA基因的检测与变异位点的分析

近年来，随着喹诺酮类药物的广泛应用，尤其是一些养殖场的盲目滥用和超量服用，导致耐药菌株不断出现。关于耐药的大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌等细菌在其螺旋酶gyrA基因的喹诺酮类药物决定区（QRDR）的突变热点已有很多报道，这些菌株的突变热点相对于大肠杆菌来说，发生在第83位和87位的氨基酸上。到目前为止，鸭疫里默氏菌螺旋酶gyrA基因还是未知的，其耐药基因的突变更没有报道。本试验测出了鸭疫里默氏菌gyrA的部分基因，找到了对喹诺酮类抗生素耐药菌株的基因突变热点和突变规律。为以后研究鸭疫里默氏菌对喹诺酮类抗生素耐药的分子机制提供了基础。     

体外诱导禽巴氏杆菌环丙沙星耐药株及耐药机制的初步分析

为了探讨在环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)药物培养后,多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)对CIP的药物敏感性变化及其耐药机制,试验采用体外递增药物浓度的方法诱导出禽源Pm标准株C48-1对CIP的耐药菌株,并对CIP耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)值变化及耐药稳定性、生化特性、生长曲线和基因组位点突变进行了研究。结果表明:诱导的CIP耐药菌株的MIC由0.25μg/mL上升至16μg/mL;与亲本株比较,生化特性与生长曲线无显著差异,但诱导株的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)gyrA基因编码的氨基酸发生了Thr99→Ala的变化,该位点突变首次发现,gyrB、parC、parE耐药基因均未发生变化。说明逐步递增药物浓度可以诱导禽源Pm对氟喹诺酮类药物的耐药性,并导致靶基因发生突变。     

禽源多杀性巴氏杆菌拓扑异构酶基因突变与耐恩诺沙星的相关性

为探讨gyrA和parC基因的突变与禽源多杀性巴氏杆菌耐氟喹诺酮类药的相关性,采用微量稀释法测定84株临床分离菌对恩诺沙星的敏感性,PCR扩增其gyrA和parC基因并测序,分析基因编码的氨基酸序列与耐药表型的关系发现,GyrA发生单点突变(S94→I或S94→R)时,细菌对恩诺沙星的耐受性明显提高,发生双点突变(S94→I和D98→N),细菌则必然获得对恩诺沙星的耐药性。ParC发生单点突变(S84→L)时,细菌对恩诺沙星的耐受性也提高。ParC的变异能与GyrA的变异起协同作用,共同提高细菌对恩诺沙星的耐受性。这些结果为今后以gyrA和parC基因为靶位,建立快速鉴定禽源多杀性巴氏杆菌对氟喹诺酮类药耐药性的方法提供理论依据。     

猪源致病性大肠杆菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区的SSOP分析

DNA旋转酶基因gyrA中喹诺酮耐药决定区碱基变换在大肠杆菌对喹诺酮的耐药性方面起着十分重要的作用.采用PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性)技术可对大肠杆菌gyrA基因QRDR的突变进行有效检测.本文以142株猪源致病性大肠杆菌氟喹诺酮药物敏感菌株为样本,测定了细菌对喹诺酮药的MIC值,结果表明142株猪源大肠杆菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的耐药率分别为78.8%,56.3%,65.5%,76.8%.猪源大肠杆菌对氟喹诺酮药物的耐药率高,且耐药菌株MIC值较大.菌株WJPE2-1(对环丙沙星的NIC为0.5μg/mL)的诱导耐药试验,结果表明,在通过药物浓度梯度连续诱导过程中获得了MIC为2,8,64,128μg/mL的四株诱导菌株,诱导菌株4对ENR、NOR、OFL、CIP的MIC值分别增加到诱导前的32,128,128,256倍,且4株诱导菌株对CIP、ENR、NOR、OFL的MIC值均呈现递增.根据GenBank注册的大肠杆菌gyrA序列设计引物,横跨gyrA的第40和118密码子位置,包含完整的QRDR,从27株不同MIC值的大肠杆菌株、ATCC25922、4株诱导耐药菌株均获得约300bp的PCR产物.采用291的交联度、12%的聚烯酰胺浓度,1×TBE,凝胶中添加5%的甘油的条件,对诱导菌株、药物敏感菌株及不同耐药水平的分离菌株进行SSCP分析,结果表明,诱导菌株的谱型与敏感对照菌不同,低MIC值菌株SSCP谱型与敏感对照与敏感对照一致性高;耐药菌株的谱型多数与敏感对照不同.四株诱导大肠杆菌PCR产物的SSCP谱型均与对照不一致,检出率为100%;27株不同耐药性的猪源大肠杆菌中,7株敏感大肠杆菌共有6株的SSCP谱型与标准敏感菌株对照一致,符合率为85.7%;20株耐药大肠杆菌其谱型与标准敏感对照一致的菌株为2株,检出率为90.0%.序列比较结果表明,敏感菌株WJPE2-1的PCR产物与敏感对照有2个碱基(第91,111位氨基酸残基位置)的差异,序列同源率为99.16%(236/238).诱导菌株1与2表现在第83位氨基酸编码序列由tcg突变为ttg,菌株3、4与菌株1、2的差异表现在第87位氨基酸编码序列由gac突变为tac.进一步分析发现,菌株WJPE2-1在第91位及111位的突变均为同义突变,即密码子的变换没有引起氨基酸残基的改变.在诱导菌株中,1与2的gyrase的第83位氨基酸残基由Ser→Leu,菌株3、4的gyrase还在第87位氨基酸残基由Asp→Tyr.表明由于QRDR内碱基的改变,引起DNA旋转酶氨基酸的变化,导致大肠杆菌产生氟喹诺酮药物的耐药性.     

山东省鸡源空肠弯曲菌喹诺酮类药物耐药机制研究

通过对采集于山东省肉鸡屠宰场的202株空肠弯曲菌进行喹诺酮类耐药分子机制的研究,包括7种可以移动耐药基因筛查,喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变检测和parC的筛查,确定了我国山东省鸡源空肠弯曲菌对喹诺酮类药物的耐药表型主要为gyrA中QRDR C-257-T突变所造成.并发现在空弯中存在于gyrA和gyrB基因上的部分沉默突变有着地域流行性特点.这些观察结果为解释我国食品动物源空肠弯曲菌耐药性现状,防控耐药空肠弯曲菌传播和流行提供基础数据.