小麦内生固氮菌分离及其ACC脱氨酶测定

【目的】了解小麦内生固氮菌数量,筛选具有ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylate, 1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶活性的小麦内生固氮菌,确定筛选菌株的系统发育地位与分类地位,为微生物肥料生产收集菌种资源。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养法筛选内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;采用ACC唯一氮源法筛选ACC脱氨酶阳性菌,比色法定量测定ACC脱氨酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育;通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列比对鉴定菌种。【结果】小麦体内固氮菌数量为（0.2-17.8）×105 cfu•g-1鲜重;分离到小麦内生固氮菌60株,固氮酶活性在1-36 nmol C2H4/h•mg蛋白,其中9株具有ACC脱氨酶活性,活性在0.87-9.32 µmol α-丁酮酸/h•mg蛋白;新分离菌株9136固氮酶活性为1.82 nmol C2H4/h•mg蛋白,ACC脱氨酶活性为9.32 µmol α-丁酮酸/h•mg蛋白,初步鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。【结论】 田间自然生长的小麦体内有大量固氮菌,数量在105 cfu•g-1鲜重,其中部分菌株具有ACC脱氨酶活性,个别菌株具有较高的ACC脱氨酶活性,可能对作物抵御不良环境具有作用。     

高效固氮菌株W12对环境因子的适应性研究

从多个固氮菌株中筛选到一株固氮酶活性较高的菌株W12,为明确该菌株对不同环境因子的适应性,本文测定了不同的生长环境条件下该菌株的生长量和固氮酶活性.结果表明,在15～40 ℃的温度范围内、pH 4～8.5酸性至碱性环境和1.5% NaCl的高渗透压下,该菌株均能旺盛生长并表现很高的固氮活性;该菌株能利用多种碳源生长并固氮,还能耐受环境中存在的一定浓度的铵.说明该菌株对环境因子具有较广的适应性,并具有较强的生长活力和较高的固氮酶活性,故可望作为接种剂的功能菌株.     

地毯草根际固氮菌的分离及鉴定

结合气相色谱仪,利用乙炔还原等方法对地毯草(Axonopus compressus)根际固氮菌进行分离和鉴定。结果表明,从地毯草根际土壤中分离获得6株固氮菌株,菌株的固氮酶活性相差较大(92.5 C2H4~295.2 C2H4nmol.mL-1.h-1),菌株hnN2及hnN6具有较高的固氮酶活性(>200 C2H4nmol.mL-1.h-1);菌株经鉴定分属Bacillus(2株)、Azotobacte(r 3株)和Pseudomona(s 1株)3个属。     

单播草地匍茎翦股颖根际联合固氮菌筛选及部分特性初探

从西安地区单播草坪匍茎翦股颖的根际分离到固氮菌株188株,通过气相色谱仪,利用乙炔还原法最终筛选出4株固氮酶活性较高的菌株进行固氮菌部分特性测定及初步对菌株进行鉴定.结果表明:4株菌株中,X4菌株固氮酶活性最高,C2H4达180.20 nmol.mL-1.h-1,与其他菌株相比差异极显著(P<0.01),X2菌株固氮酶活性最低,C2H4为39.32 nmol.mL-1.h-1;筛选出的4株菌株除X4菌株生长较慢外,其余菌株都生长迅速;X2、X3和X4菌株为革兰氏阳性菌株,X1为革兰氏阴性菌株;除X4为中性兼性厌氧性菌株外,其余均为碱性好氧性菌株.经生理生化实验初步鉴定,X1和X4分别属于Enterobacters和Staphylococcu属,X2和X3菌株属于Bacillus属.     

几种木本植物联合固氮细菌的研究—联合固氮细菌的分离鉴定及固氮活性

在几种木本植物杨树，杉木，油茶根际存在着联合固氮体系，从它们根际分离到26株具有较高固氮酶活性的菌株，筛选了4株具有高固氮活性的菌株Aa33,Ba41,y12,Y22进行固氮特性研究，并选择菌株y12,Y22进行形态，培养特征及生理生化研究，初步鉴定为黄杆菌属Flavobacterium和产碱菌属Alcaligenes，这对今后开展木本植物固氮领域的研究及其利用具有现实的指导意义。     

玉米内生联合固氮菌的分离与鉴定

试验对玉米内生固氮菌进行分离、鉴定,并研究内生细菌与玉米的联合固氮活性。结果表明,从玉米中分离出5株具有联合固氮活性的菌株,分别为1株弯曲假单胞菌NFR19(Pseudomonas geniculata),2株产酸克雷伯氏菌NFL28与NFSt18(Klebsiella oxytoca),1株节杆菌NFR7(Arthrobacter sp.),1株纤维化纤维菌NFR10(Cellulosimicrobium cellulans)。研究首次分离出具有固氮活性的纤维化纤维菌,并证实节杆菌具有固氮活性。从环境中筛选新的玉米内生固氮菌资源,促进玉米生长,为玉米内生联合固氮细菌的应用奠定基础。     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

沙枣、沙棘Frankia放线菌回接试验

<正> 沙枣、沙棘是新疆荒漠盐碱土上的先锋植物,具有抗寒、抗旱、防风固沙和耐盐碱的特性,同时也是新疆非豆科固氮树种。60年代超显微结构研究证实,非豆科树木根瘤内生菌是放线菌。自1986年以来,我们对南北疆沙枣沙棘根瘤内生菌—Frankia放线菌进行了分离纯化,共得到38株菌株,其中从小沙枣根瘤中分离得到15株,大沙枣20株,沙棘3株。为了证实这些放线菌是否确是沙枣沙棘根瘤内生菌—Frankia放线菌典型菌株,我们于1987—1988年作了回接试验,并从中筛选出抗逆性强、固氮能力较高的4株菌种。     

高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性

 【目的】筛选高效固氮芽孢杆菌,研究固氮微生物固氮酶活性、竞争适应能力与接种固氮效能的关系,探讨接种固氮芽孢杆菌对根际细菌多样性的影响。【方法】采用无氮培养基富集、加热筛选固氮芽孢杆菌。乙炔还原法测定固氮酶活性,采用盆栽小白菜选育高效固氮芽孢杆菌、研究菌种竞争适应能力与接种固氮效能。通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种。【结果】筛选到了3株固氮酶活性相对较高、固氮能力较强的菌株GD062、GD082和GD282,初步鉴定为芽孢杆菌Bacillus spp.和类芽孢杆菌Paenibacillus sp.。进一步的研究结果表明菌株GD082竞争适应能力较强,在盆栽试验自然土壤条件下接种固氮效能与施用化肥试验处理效果相当,可望进一步研发用于生产固氮微生物肥料。试验结果同时显示,供试菌株的固氮酶活性与其接种固氮效能并不直接相关,菌株的竞争适应能力对接种固氮效能影响很大,接种固氮芽孢杆菌使小白菜根际土壤细菌多样性显著增加。【结论】接种固氮微生物为农作物提供氮素养分具有生产实践意义。高效固氮菌种的筛选是一个复杂的过程,菌株的固氮酶活性与其接种固氮效能并不直接相关,竞争适应能力对接种固氮效能影响很大。筛选到的芽孢杆菌GD082固氮酶活性较高、固氮能力较强、竞争适应能力很强,可望进一步研发成为优良的固氮微生物肥料生产用菌种。     

水稻根系内生固氮菌的分离鉴定及其促生作用研究

【目的】研究不同生育期水稻根系内生固氮菌的多样性,分离鉴定内生固氮菌并筛选具有促生作用的菌株,为水稻生产中固氮菌的应用提供理论依据。【方法】采用无氮培养基培养方法,从拔节期和抽穗期佳辐占根系中分离内生固氮菌,通过扩增16S rRNA方法进行分子鉴定和系统进化分析;采用透明圈法进行溶磷解钾能力验证;采用乙炔还原法测定固氮酶活性。将分离的内生固氮菌株单独接种盆栽水稻幼苗,测定其对株高、根长、鲜质量的影响;将内生固氮菌混合菌液接种水稻品种佳辐占和台粳8号,于齐穂期测定倒1、倒2和倒3叶片的叶绿素含量（SPAD值）。【结果】从拔节期和抽穗期水稻根系中分别分离出10和20株内生固氮菌,且两个时期水稻根系内生固氮菌群多样性存在差异,拔节期以克雷伯氏菌属为主,而抽穗期以假单胞菌属为主。筛选出7株具有溶解无机磷能力的菌株,分别是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37。乙炔还原法测定结果表明,分离的内生固氮菌均具有弱固氮活性,其中 H33和H40-2菌株固氮能力相对较强。将固氮菌回接水稻幼苗,H40-2和J3菌株对水稻株高、地上鲜质量、根长均有显著影响,可促进水稻生长。将固氮菌混合回接水稻根系,发现佳辐占叶片叶绿素含量与对照差异不显著,而台粳8号显著提高。【结论】分离的内生固氮菌株H40 2和J3在水稻苗期具有明显促生作用,可作为功能性内生固氮菌开发利用。     

弗兰克氏菌Cel 517菌株固氮研究

由木麻黄（ＣａｓｕａｒｉｎａｅｇｕｉｓｅｔｉｆｏｌｉａＬ）根瘤中分离的内生菌ＦｒａｎｋｉａｓｐＣｅｌ５１７菌株,可在以丙酸为碳源的限定培养基中表现出较高的固氮酶活性。固氮周期在１８０ｈ达到高峰。蛋白胨与ＮＨ４Ｃｌ对固氮活性有抑制作用,氧分压为１０％～１５％时,固氮酶活性最高,泡囊的诱导时间对固氮酶活性影响较大。     

当归和羌活根际促生菌筛选及特性研究

为获取对当归和羌活生长具有促生作用的促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR),以当归、羌活的根系为研究对象,利用选择性培养基分离具有固氮、溶磷和分泌3-吲哚乙酸(IAA)能力的菌株。通过对菌株的固氮酶活性、溶磷能力及分泌IAA的能力进行测定,筛选出促生性能优良的菌株;进一步通过生理生化指标和16S rDNA序列分析相结合的方法分析优良菌株的分类地位。结果表明,共筛选到12株具有固氮酶活性的菌株,其固氮酶活性为0.30～4.04 nmol C₂H₄·mL^-1·h^-1;6株溶解无机磷的菌株,溶磷量为290.98～420.33μg·mL^-1;3株产IAA的菌株,IAA分泌量为10.38～18.63μg·mL^-1。经鉴定,溶磷特性优良的菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)和错玫杆菌属(Falsirhodobacter),假单胞菌属为优势菌属。综合各菌株的促生特性,筛选出2株促生性能优良的菌株：WQP-5(...     

新造地马铃薯根际固氮解磷微生物的分离与鉴定

【目的】揭示马铃薯根际土壤固氮解磷菌类群,分析其固氮酶活性和溶磷能力,为利用新造地作物根际促生菌提供依据。【方法】以采自延安市安塞区新造地的马铃薯根际土壤为供试样品,采用Ashby培养基和无机磷培养基分离纯化马铃薯根际固氮解磷菌,以16S rDNA基因分析马铃薯根际微生物类群组成,以乙炔还原方法测定其固氮酶活性,以溶菌圈法和钼蓝比色法测定其溶磷能力。【结果】从延安新造地马铃薯根际土壤中分离并筛选到9株固氮解磷菌,经鉴定分别属于假单胞杆菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Paenarthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、贪噬菌属(Variovorax)、肠杆菌属(Kosakonia)和副球菌属(Paracoccus)等8个属;9株固氮解磷菌均具有固氮和溶磷特性,其固氮酶活性在11.88～95.08 nmol/h,其中菌株N34的固氮酶活性最高,且与其他菌株的固氮酶活性差异显著;9株固氮解磷菌株溶磷能力存在一定的差异,溶磷能力为22.05～54.9 mg/L,其中菌株N46的溶磷能力最好,7 d累积溶磷能力达到54.9 mg/L。【结论】分离纯化得到的9株固氮解磷菌均具有一定的固氮解磷能力,可用于开发马铃薯功能菌肥。     

青藏高原矮火绒草内生细菌多样性及生物功能分析

[目的]探究矮火绒草(Leontopodium nanum)内生细菌的群落结构多样性及其生物学功能,为开发相应功能的生物菌剂提供参考,并为青藏高原生态农牧业生产提供有价值的内生细菌资源.[方法]采用组织分离法对矮火绒草植株内生细菌进行分离纯化,基于16S rDNA序列分析确定分离菌株的系统发育地位;通过平板对峙法检测分离菌株拮抗病原真菌活性;检测分离菌株的产吲哚乙酸(IAA)、溶磷和固氮能力;测定分离菌株除草活性、低温适生性及促种子萌发特性.[结果]从矮火绒草植株根、茎、叶和种子部位共分离获得52株内生细菌,基于16S rDNA序列分析发现52株菌株可归属于4门7纲10目14科18属.其中假单胞菌属细菌为根部优势属,约占根部细菌总数的52.17%;茎中以芽孢杆菌为优势属,约占茎部细菌总数的41.18%;各部位的内生细菌数量分布表现为根>茎>种子>叶.在52株内生细菌中,11株有拮抗病原真菌能力、9株具有产IAA能力、7株有溶磷活性、7株具有固氮活性、20株具有除草活性、13株具有耐低温能力和8株具有促生作用;从植株部位分布来看,7种类型的功能菌在根、茎和种子部位均有分布,拮抗菌和除草菌在根部所占的比例较高,溶磷菌株在各植株部位所占比例均较低;在叶中未分离到拮抗菌、产IAA菌、固氮菌和促生菌.各功能菌株分布在17个属,多样性较高,其中假单胞菌属和芽孢杆菌属中含有多种功能菌株,在植株4个部位所占比例也较高.[结论]矮火绒草植株不同部位内生细菌的数量分布具有差异性,但均可分离到不同类型的功能菌株,功能菌株涵盖17个属,其中以假单胞菌属和芽孢杆菌属居多.     

水稻根系联合固氮的研究 Ⅱ.水稻根系固氮酶活性的测定及固氮微生物的分离

本文报道在福建部分地区及盆栽中采集的800多个根样包括97个水稻品种的固氮酶活性检测结果及根系固氮微生物的分离。通过测定发现水稻根系具有固氮酶活性是较为普遍的,采用切根加培养基预培养后,其根内固氮酶活性出现率可达70～90％以上。水稻根系具有固氮酶活性的样品的分布,与水稻品种、植株生育期、种植地区以及土壤环境有关,固氮酶活性较高的根样大多出现在省肥耐瘦株型紧凑的品种,纬度较低、气候温暖的闽南地区,处于孕穗—灌浆的生育期以及盐碱土、坑田的土壤环境。几年来从有固氮酶活性的根系中分离到菌株1,317个,其中表现固氮酶活性的473株,占分离总数的36％。并发现这些分离的固氮茵的生长和固氮需要含有少量有机氮(如酵母膏)的培养基,对氧分压的要求因菌株不同而异。还检到一些真菌具有乙炔还原活性。     

草莓体内高ACC脱氨酶活性菌株的分离及鉴定

[目的]分离草莓体内具有较高ACC脱氨酶活性的菌种,丰富具有果蔬保鲜价值的植物内生菌资源。[方法]采用ADF培养基分离具有ACC脱氨酶活性的细菌,并且用生理生化和分子生物学方法进行鉴定,将具有ACC脱氨酶活性的菌株在草莓中定植。[结果]分离出具有ACC脱氨酶活性的内生细菌23株,其中CJL1菌株的ACC脱氨酶活性最高,比活力达0.142U/mg。CJL1菌株为成团泛菌,能够在草莓体内稳定地定植。[结论]成功地在草莓体内分离得到具有高ACC脱氨酶活性并能定植的成团泛菌。     

固氮类芽孢杆菌的分离鉴定及其促生、抑菌活性的测定

固氮类芽孢杆菌是一类能产生芽孢、具有固氮能力的革兰氏阳性细菌。这类菌除固氮活性和抗逆力强外,有些菌株还具有促进植物生长、对植物病原菌有抑制作用、耐贮藏等特点,被认为是制备微生物肥料的优良菌种之一,但目前经过鉴定的菌种资源十分有限。从全国20个省不同地理环境、不同种类植物根际采集分离筛选获得500个菌株,从中鉴定出60个具有固氮结构基因(nif H)的分离株,通过对其中17个分离株的nif H和16S rRNA基因序列的比对分析,初步确定了它们的系统发育地位,17个分离株均属于固氮类芽孢杆菌,而且这17个菌株全部具有固氮酶活性,最高达到2 109.9±131.1 nmol/mg·h。进一步分析,其中5株具有IAA分泌能力,最高为49.908±3.6μg/m L,11株对4种常见植物病原菌表现出抑制作用。在17个分离株中,共发现了5株兼具固氮、分泌IAA以及抑制植物病原菌的特点,其中IAA分泌能力最低的BJ-18对番茄幼苗仍具有显著的促生作用。分离和鉴定的固氮类芽孢杆菌丰富了固氮微生物菌种资源,发现的兼具固氮、分泌IAA以及抑制植物病原菌的固氮类芽孢杆菌在农业生产中具有潜在的广泛应用前景。     

多功能芽孢杆菌的分离、筛选及活性测定

从小麦、禾本科杂草根际取样,分离固氮芽孢杆菌,并测定各菌株的抑菌活性及降解有机磷农药的能力,筛选多功能芽孢杆菌菌株.结果表明,分离筛选的11株固氮芽孢杆菌主要包括胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus);其中7株菌株对立枯丝核菌和禾谷丝核菌两种病原菌具有明显的抑菌活性;5株菌株能有效降解甲胺磷和甲基对硫磷两种有机磷农药.巨大芽孢杆菌BM3和地衣芽孢杆菌BL6具有明显的固氮、抑菌和降解有机磷农药等多种功能活性.     

植物抗镉内生细菌筛选及其对小麦幼苗耐镉能力的影响

[目的]筛选出抗镉内生细菌,为应用植物—微生物联合修复技术修复镉污染土壤提供优势菌株.[方法]对秦岭铅锌尾矿区内优势植物杠柳(Periploca sepium Bunge)和草木樨(Melilotus suaveolens Ledeb)的内生细菌进行分离,筛选出具有较高镉抗性的内生细菌,进行16S rDNA序列分析,对其Cd2+去除率、吲哚乙酸(IAA)活性、铁载体活性和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性等生物学特性进行研究,并利用盆栽试验验证其提高小麦幼苗耐镉胁迫的能力.[结果]在800 mg/L Cd2+浓度条件下共分离筛选得到11株抗镉内生细菌(GS3、CR4、CG7、GR31、GR38、GR42、GR43、GR44、GR45、GR49和GR54),经鉴定均为芽孢杆菌(Bacillus sp.).生物学特性研究结果表明,在800 mg/L Cd2+浓度条件下11株内生细菌的Cd2+去除率在14.56%~79.45%,其中GR44的Cd2+去除率最高;7株内生细菌有IAA活性,其中GR44、GR49和CG7的IAA活性较高;11株内生细菌均有铁载体活性和ACC脱氨酶活性,其中GR44的铁载体活性最高,GR54的ACC脱氨酶活性最高.小麦盆栽试验结果表明,GR44能显著提高小麦幼苗的耐镉能力(P<0.05).[结论]筛选出的抗镉内生细菌GR44可作为植物—微生物联合修复技术中修复镉污染土壤的优势菌株,对矿区复垦具有一定意义.     

24株剑麻根际联合固氮菌的16S rDNA序列分析

对海南、广西和广东剑麻主产区种植基地的剑麻根际联合固氮菌进行了分离、纯化及固氮活性测定,获得了24株具有固氮活性的菌株,其固氮酶活性为5.8742～1765.6590 nmol/(mL.h)。16S rDNA序列分析结果表明:参试菌株的16S rDNA扩增区约为1500 bp,无太大的长度变异,其系统发育树表明这24株菌株分别属于6个不同的属。