侵染小苹果的苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

小苹果是抗寒海棠类与大苹果的杂交后代,因耐寒能力强,口感好,被广泛用于嫁接与育种材料,是我国寒凉苹果产区宝贵的种质资源。苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)侵染苹果后引起果实表面产生锈状斑、花脸、畸形等症状,严重降低果实品质和市场价值。2013年在调查苹果病毒病时发现北京市延庆县种植的小苹果表现出典型畸形症状,应用RT-PCR方法对其进行检测后经测序和序列分析表明,小苹果被苹果锈果类病毒侵染。克隆此分离物(ASSVd-YQ)全基因组序列,分析后得到其基因组全长为329个核苷酸,系统发育分析表明该分离物与来自不同国家和地区的ASSVd分离物间的进化关系极近。二级结构预测表明,该分离物的中央保守区与末端保守区与ASSVd参考序列相同。这是对侵染小苹果的ASSVd的首次检测和鉴定。     

我国部分苹果产区苹果锈果类病毒的检测和全序列分析

近年来,由苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)引起的苹果花脸病、锈果病在我国一些苹果产区日趋严重,对我国苹果生产和苹果产业发展造成严重危害。为了解ASSVd在我国一些苹果产区的发生和变异情况,采用RT-PCR对陕西、山东、山西、河北、北京和黑龙江6个苹果产区的35份苹果样品进行检测,并克隆获得30个分离物的基因组全序列,大小为330~333个核苷酸。分析表明,这些分离物的基因组全序列与GenBank中ASSVd基因组核苷酸序列相似度为96%~100%,在苹果锈果类病毒属的末端保守区及中央保守区保守,在致病区和左端区域有突变,一些分离物的突变位点相同。系统发育分析表明分离物因相同的突变位点而聚类,而与地理来源无关。     

烟台市富士苹果上苹果锈果类病毒分子变异分析

为明确苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)在烟台市富士苹果上的变异情况,通过特异性引物对携带苹果锈果类病毒的富士嫩叶进行ASSVd全长扩增,利用生物学软件DNAMAN对所得变异序列进行分析并构建系统进化树。结果表明,从130个样品中筛选到36个阳性样品,36个阳性样品中共克隆获得52条329~333 nt的ASSVd变异序列,其中30个阳性样品含2条或2条以上的ASSVd序列。对所得变异序列进行序列比对发现,同一样品不同克隆间核苷酸序列相似性为94.0%~100.0%,所有变异序列核苷酸序列相似性为94.0%~99.7%,与Gen Bank中来自不同国家或地区的10条ASSVd分离物核苷酸序列相似性为88.3%~99.7%。将序列相似性低于97.0%的12条变异序列进行系统进化分析,结果显示除了333 nt变异序列ZS2-6与伊朗苹果分离物在同一分支外,其余11条变异序列位于同一分支。52条变异序列多序列比对发现,变异位点主要集中在TL区、P区和C区。研究表明烟台市富士苹果上ASSVd存在一定的分子变异。     

北京平谷区苹果锈果类病毒检测初报

采集北京市平谷区‘中秋王’、‘寒富’苹果叶片样品共12份,以Northern杂交、RT-PCR方法检测苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)带毒情况。结果表明,表现明显锈果症状的‘中秋王’样品均检出ASSVd,无明显症状的‘中秋王’样品没有检出ASSVd,而无明显症状的‘寒富’样品全部携带ASSVd。测序发现,所得序列与NCBI中已报道的ASSVd基因组序列相似性为91%~99%,且两品种中ASSVd主流序列完全相同。结果说明‘中秋王’对ASSVd较为敏感,感病后易于表现出明显的锈果症状;‘寒富’对ASSVd耐性较强,感病后不表现出明显症状。     

苹果锈果类病毒(ASSVd)的种群及遗传变异分析

苹果锈果类病毒apple scar skin viroid(ASSVd)引起苹果锈果病,是限制我国苹果生产的重要因素之一。然而,目前对ASSVd全球种群的组成及遗传变异仍缺乏足够的了解。为此,本研究对GenBank中登录的212条基因组序列进行了比较、变异分析以及系统发育分析。确认ASSVd的种群符合准种模式,由165种序列相似但不相同的变体组成。以来自我国苹果的MW315909和MW302328为代表的两种变体的数量最多,是主流变体。依据参考序列(NC001340)分析碱基变异,发现碱基变异偏好于某种碱基,并且偏好于基因组上的一些特定位点。变异不仅发生在基因组二级结构的左末端区、致病区、中央区,也发生在可变区和右末端区。值得指出的是,基因组上有4个区域极少发生变异,为保守区。其中的两个保守区(末端保守区和中央保守区)是已知的,而在可变区与右末端区交界处的两个保守区是新发现的,它们对ASSVd的复制和移动可能具有重要作用。这些结果不仅有助于掌握ASSVd的发生及流行,而且为研发RT-PCR/qPCR检测技术提供了参考,为研究ASSVd与寄主的相互作用提供了线索。     

苹果花脸和锈果症状伴随的苹果锈果类病毒分离物的分子特性分析

苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid, ASSVd)侵染引起苹果花脸病和锈果病,近年来对我国苹果产业造成了严重损失,但造成两种症状差异的分子特性尚不明确。本研究前期从我国山东和山西收集表现花脸和锈果症状的苹果果实样品,进行了克隆和测序,获得56个ASSVd分子变种的全长核苷酸序列,长度在330～333 nt之间。通过对本研究获得的ASSVd分子变种比对分析及与报道的症状相关分子变种间的比较,表明花脸和锈果症状的ASSVd分子变种之间的一致率为86.9%～100%,变异率为0.0%～13.3%,均有4个主要变异区域(含21个变异位点),位于致病(P)区、P区与左端区(T_L)邻接区域及P区与中央保守(C)区的邻接区域,二级结构呈紧凑的棍棒状。选取我国症状相关及国内外其他代表性ASSVd分子变种进行进化分析,显示我国ASSVd分离物分为7个簇(Ⅰ～Ⅶ),且两种不同症状相关分子变种聚在相同簇(Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ)。其中,ASSVd簇Ⅰ为优势组群,含有我国新疆及其他地区和希腊及其他国家来源的分离物,推测为原始组群;簇Ⅱ、Ⅳ、V和Ⅶ表现出明显的我国地域专化性,...     

苹果锈果类病毒陕西秦冠分离物的鉴定与序列分析

<正>陕西省是我国苹果种植大省,苹果锈果病的发生严重影响其苹果产业,该病是由苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)引起的,陈炜和田波(1985)首次在国内发现了ASSVd的RNA,HashimotoKoganezawa(1987)首次报道了ASSVd的全基因组序列。郭瑞等(2005)报道了我国ASSVd辽宁和新疆苹果分离物的序列,郝璐等(2015)发现ASS-     

苹果锈果类病毒山东栖霞分离物的分子鉴定及序列分析

本研究以采自山东省栖霞市的两个苹果样品为试验材料,利用二维电泳、斑点杂交、RT PCR等分子生物学技术对样品中的苹果锈果类病毒(ASSVd)带毒情况进行了检测。结果表明：两个样品均携带ASSVd。对两个样品中的ASSVd进行克隆测序,并利用生物学软件DNAMAN对所得序列进行分析,结果表明：与世界上首次报道的ASSVd序列(X17696)相比,本研究所得到的ASSVd序列变异较小,相对比较保守。     

不同龄期枝条对苹果轮纹病菌的抗病性研究

本研究采用轮纹病菌分生孢子和菌丝接种不同龄期的苹果枝条,检测枝条皮孔发病率,以明确不同龄期苹果枝条对轮纹病菌的抗病性差异.结果表明,当年生‘富士’苹果枝条的幼嫩部分接种后发病最重,皮孔的发病率达80％以上,随枝条的生长发育,抗病性逐渐增强,枝条发育成熟后,皮孔发病率降至40％左右.在7月份接种的1～5年生‘富士’苹果成熟枝条中,皮孔的发病率没有显著差异.在8月份接种的‘富士’苹果枝条中,1年生枝条的皮孔发病率显著高于5年生枝条的发病率.未发育成熟的苹果枝条对轮纹病菌的抗侵入能力差,枝条发育成熟后抗病能力明显增强.1～5年生枝条上发育完整的皮孔对轮纹病的抗侵染能力没有显著差异,但在枝条的迅速加粗生长期,低龄枝条上皮孔结构变化更大,对轮纹病菌的侵入也更敏感.     

苹果锈果类病毒在八棱海棠种子中的分布及氢氧化钠脱毒效果分析

为明确苹果锈果类病毒在八棱海棠果实和种子中的分布特征、种传率以及药剂脱除效果,以带毒母株上的八棱海棠果实和种子为试材,运用RT-PCR技术分析了八棱海棠果实不同部位锈果类病毒的带毒率、实生后代的带毒情况以及氢氧化钠脱除病毒的效果。结果表明,八棱海棠果皮、果肉、种子以及种胚均不同程度携带苹果锈果类病毒,其带毒率分别为96.0%、96.0%、52.0%和4.0%;该病毒可经种子传递给后代,种传率为12.1%;经2%氢氧化钠溶液浸种10、15、20 min,种子的病毒检出率均为0,但后代实生苗的带毒率分别为2.5%、1.3%和0。表明苹果锈果类病毒可侵染种子不同部位并经种子传递给后代,氢氧化钠浸种是脱除该病毒的有效方法。     

葡萄溃疡病菌转化子致病力快速评价体系的建立

为探索快速、稳定、高效的葡萄溃疡病菌转化子致病力评价方法,分别采用无伤接种、昆虫针针刺接种、打孔器打孔接种等3种接种方法,将随机选取的来自葡萄溃疡病菌REMI转化子库的50株转化子分别接种‘富士’苹果果实和‘夏黑’葡萄一年生绿枝条,测量病斑大小.结果表明,用葡萄绿枝条接种能区分不同转化子的致病力,而苹果果实则仅能将致病力减弱的转化子筛选出来.在葡萄绿枝条上致病力减弱的转化子有96.15％在‘富士’苹果果实上的致病力也是减弱的,而用苹果果实接种未筛选到致病力增强转化子.上述结果为获得致病力突变体奠定了基础.     

利用两种方法检测苹果锈果类病毒

以克隆ASSVd的部分序列,通过RT-PCR成功合成了地高辛标记的cDNA探针,提取苹果和梨树枝条的总RNA,用斑点杂交技术对其进行了检测试验,结果表明,探针具有很高的灵敏度和特异性。地高辛标记的cDNA探针不与阴性对照枝条RNA以及感染PBCVd、AFCVd、ADFVd枝条总RNA发生杂交,仅与感染ASSVd样品的总RNA杂交。     

苹果锈果类病毒的几种提取方法及RT-PCR检测灵敏度的比较

以感染苹果锈果类病毒的苹果枝条为材料,利用不同的方法抽提,进行RT-PCR检测。比较了6种RNA的提取方法,结果发现:LiCl法、RNeasy plant mini kit和NA-PEX法检测效果较佳。RNeasy plant mini kit可检测到10-2,NA-PEX可检测到10-1;RNeasy plant mini kit检测效果好于NA-PEX,但价格比较贵,需要研磨;NA-PEX法组织无需液氮研磨,试剂便宜,耗时短,适合检测大批量的样品。     

苹果茎痘病毒在山楂中的首次鉴定与序列分析

 山楂是我国重要的果树,但山楂病毒的相关研究较少。本研究通过高通量测序及生物信息学分析首次在山楂样品中发现苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)。利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术对ASPV山楂分离物全长序列进行扩增,结果表明,ASPV山楂分离物基因组全长由9 290个核苷酸组成,包含5个开放阅读框(open reading frames,ORFs)。ORF1编码与病毒复制相关的蛋白-RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp),其在氨基酸水平上与ASPV苹果和梨分离物的RdRp序列相似性分别为72.8%~80.9%和81.7%~92.8%;ORFs 2~4表达与病毒移动相关的三基因块(triple gene block 1~3,TGB 1~3),其与印度苹果N分离物(LM999967)的氨基酸序列相似性最高,为92.9%~98.2%;ORF5编码外壳蛋白(coat protein,CP),与苹果和梨分离物CP的序列相似性较低,分别为64.8%~88.4%和69. 8%~92.2%,高于目前凹陷病毒属病毒新种的划分界限。将ASPV山楂分离物的全长核苷酸序列与其他ASPV分离物的全长序列进行比对,构建系统发育树,结果表明,ASPV山楂分离物与巴西苹果分离物BR-Brae2的亲缘关系最近,但两者核苷酸序列相似性较低(81.5%),说明与其他分离物相比该分离物具有较大的变异性。综上,本研究初步验证了山楂是ASPV的重要自然寄主,并首次获得了ASPV山楂分离物的全长基因组序列,为山楂病毒病诊断和防控策略的制定提供参考。     

实时荧光定量PCR(SYBR Green I)检测不同抗枣疯病枣树品种嫁接接穗中的植原体浓度

在枣疯植原体16S r DNA片段内设计并合成引物对DZ16SF-2/DZ16SR-2(扩增190 bp片段),用重组质粒p MD18-DZ16S为模板建立标准曲线,并建立枣疯植原体实时荧光定量PCR(SYBR Green I)检测体系。溶解曲线分析显示:该引物特异性好,该体系对质粒模板的检测灵敏度达102copies/μL。利用该体系对不同月份、不同发病级别的嫁接接种枣树接穗样品进行植原体含量测定。通过对高抗品种‘星光’,中抗品种‘黑腰子枣’、‘嘎嘎枣’和‘葫芦枣’,感病品种‘月光枣’、‘马牙枣’、‘莲蓬子’、‘北流西冬枣’和高感品种‘大红袍枣’嫁接到发病‘冬枣’砧木上所表现出的不同病级、病情指数和病原浓度比较结果发现,表现无症状的样品中植原体的含量在每克鲜重105~106个,发病Ⅰ~Ⅱ级枝条中植原体浓度在106~107个/g,Ⅲ~Ⅳ级发病枝条含量在107~108个/g鲜重,而V级发病枝条达到每克鲜重109个,表明接种发病的接穗症状严重度与其体内植原体浓度积累密切相关。高抗枣疯病‘星光’品种嫁接接穗体内病原浓度明显低于感病品种,而且有较多‘星光’接穗嫁接的发病砧木症状有所减轻,植原体浓度也有所降低。本研究可为探索枣树品种的抗病机制、抗病性鉴定及枣疯病植原体的防治提供参考。     

苹果锈果病的病原

 从苹果锈果病枝条减压抽取出输导组织液,在其离心沉淀物的超薄切片中,电镜检查到形态类似立克次体的难养细菌(fastidious bacteria)。病株花柄和幼嫩果柄的超薄切片中也观察到这种细菌。健树制备的对照样品中没有。从锈果病带病者——梨树中也发现有这种菌。用难养菌液接种,苗木叶片表现典型的弯叶症状。青霉素处理有减轻病情的疗效。可以认为这种难养菌是引起苹果锈果病的病原物。     

我国北方部分苹果主产区病毒病的发生与检测

苹果病毒病在我国广泛发生,已成为限制我国苹果优质高产的关键因素。20世纪80年代曾对其做过详细的调查和研究,但近年来由于各地农业产业结构调整等因素,苹果病毒病的发生特点有了不同程度的变化。为了解目前我国苹果病毒病的发生情况,在我国北方苹果主产区山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市的部分地区采集苹果样品共计267份,经RT-PCR检测和扩增产物的克隆与测序分析表明在上述地区采集的样品中,苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)的发生率分别为66.7%~100.0%、38.1%~94.1%、4.8%~85.7%和4.8%~48.6%;苹果凹果类病毒(ADFVd)仅在山东的两个果园零星发生;6个省市样品中病毒复合侵染率分别为67.1%、92.1%、75.0%、88.2%、94.1%和76.2%。     

云南昭通苹果早期落叶病流行动态

苹果早期落叶病是影响苹果生产的重大病害,据报道苹果早期落叶病是褐斑病[Marssonina coronaria(Ell.et Davis)Davis]、斑点落叶病(Alternaria mali Roberts)、灰斑病(Phyllosticta pirinaSacc.)等多种病害的统称。通过在云南昭通系统调查影响苹果早期落叶病的主导因素品种及栽培模式,检测和统计病原菌种类及数量,调查早期落叶病发病率和病情指数,结果表明云南昭通苹果产区早期落叶病主要包括由M.coronaria引起的褐斑病和由A.mali引起的斑点落叶病,没有发现由P.pirina引起的灰斑病和其他病害。早期落叶病发病时间与品种关系密切,‘金帅’从5月下旬开始发病,8月初为发病高峰,9月底病害结束。‘红富士’则5月中旬开始发病,8月底达到发病高峰,10月底结束。不同品种和栽培方式对早期落叶病的发生程度有显著影响。     

进境苹果果实中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定

对来自美国的苹果进行了病原菌分离,结果在果实中分离到1株疑似苹果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968。对其进行了病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测,实验结果表明,菌株Nk-2968在PDA培养基上生长良好,能产生大量的分生孢子;经真菌通用引物(ITS4/ITS5)及β-tubulin引物(Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo)分别扩增和测序,菌株Nk-2968与Gen Bank中登录号AF281462.1、HG793110.1和HG793112.1的菌株序列同源性达到100%;病菌接种苹果8 d后开始发病。根据上述实验结果,将分离获得的菌株Nk-2968鉴定为苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea kienholzii)。这是我国口岸首次在进境的苹果果实上截获该危险性有害生物。