早孕因子多克隆抗体的制备及应用

通过含有家兔早孕因子的重组质粒EPF-pET-32a(+)转化表达宿主菌Escherichia coli Rosetta,IPTG诱导,融合表达硫氧还原蛋白-兔早孕因子Trx-EPF.亲和层析纯化Trx-EPF,并在柱上进行肠激酶酶切,得到EPF蛋白并进行复性.EPF免疫波尔山羊,制备羊抗兔家兔早孕因子抗血清,硫酸铵沉淀纯化多克隆抗体,用于家兔早孕检测.Western-blot结果表明,羊抗兔家兔早孕因子多克隆抗体对家兔早孕的检出率达到100％.     

绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

为制备绵羊早孕因子(EPF)单克隆抗体,以纯化的EPF重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选单克隆抗体细胞株,将筛选的细胞株注入小鼠腹腔得到腹水型抗体,用G-sepharose柱亲合层析法对小鼠腹水型抗体进行纯化,应用SDS-PAGE和Western blot分析抗体纯化后的纯度及特异性。结果显示,细胞融合后得到了1株抗绵羊EPF单克隆抗体的细胞株B4D5,纯化后的腹水型单克隆抗体纯度较高,具有较强的特异性,应用单克隆抗体检测绵羊妊娠准确率为81.3%。表明,制备的绵羊早孕因子单克隆抗体为特异性抗绵羊EPF抗体。     

早孕因子的研究进展

早孕因子(EPF)是哺乳动物受精后最早在血清中检测到的妊娠相关蛋白,具有免疫抑制和生长调节作用,本文结合对早孕因子EPF的来源、生物学特性和作用机制,以及其早孕因子的应用研究进展进行了论述。     

牛红细胞源抗菌肽的分离纯化与活性鉴定

【目的】分离纯化牛红细胞中的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs),并对其体外抗菌活性进行初步检测。【方法】以中国荷斯坦奶牛血液为材料,通过离子交换层析法和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化抗菌肽,用琼脂糖平板扩散法测定其抗菌活性,并用质谱法测定其分子质量。【结果】牛血液红细胞粗提物经离子交换层析获得的阳离子峰有抗菌活性;阳离子峰经RP-HPLC纯化后,共得到4个峰(F1、F2、F3和F4),其对大肠杆菌均具有抗菌活性,F1峰和F3峰对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,仅F1峰对白色念珠菌具有抗菌活性;经质谱分析,F1峰纯化肽的分子质量为2 562.40 u。【结论】成功地从牛红细胞中分离纯化到了AMPs;F1峰中AMPs的抗菌谱较广,抗菌活性较强。     

应用猪Ea花环抑制试验测定山羊和牛EPF活性

应用猪淋巴细胞Ea花环抑制试验,建立了山羊和牛EPF测定的方法,并用该法检测了山羊和牛妊娠早期血清中EPF的活性.试验结果表明,猪淋巴细胞Ea花环抑制试验可应用于二者EPF活性的测定;妊娠早期(1～21 d)山羊血清中存在EPF活性,其RIT值平均为16.9±1.8,第1天和第8天出现活性峰值(RIT值分别为18.8±1.1,21.2±1.8),其余时期EPF活性相对稳定,呈现一定的规律性变化;奶牛在妊娠第15天可检测到高活性的EPF(10.86±l.07),与空怀奶牛(4.07±0.89)相比,差异极显著(P<0.01).     

Paenibacillus polymyxa CP7菌抗革兰氏阴性菌活性组分的分离和结构分析

 【目的】分离和纯化Paenibacillus polymyxa CP7菌抗革兰氏阴性菌的活性组分,并鉴定其结构。【方法】采用固相萃取柱分离、阳离子交换层析、凝胶过滤层析和HPLC层析等技术对活性组分进行分离纯化,通过紫外-可见光谱、圆二色光谱、红外光谱和MALDI-TOF-TOF-MS质谱对所分离组分进行结构鉴定。【结果】从CP7菌发酵液中分离获得抗革兰氏阴性菌的B、C1和C2组分,分子量分别为1 155、1 169和1 191 D。并确定了C1组分的分子式为C53H100O13N16,结构由6个L-α,β-二氨基丁酸（DAB）、2个苏氨酸和2个亮氨酸组成,与多粘菌素E1的结构相同。【结论】从CP7菌发酵液中分离获得了3种抗革兰氏阴性菌的小分子多肽。经测试确认C1组分为多粘菌素类E1。推测B组分也是多粘菌素类的1个成员,而C2组分则可能是多粘菌素家族中的一个新成员。     

小麦木聚糖酶抑制蛋白的分离纯化及其性质研究

【目的】从成熟的小麦籽粒中纯化小麦木聚糖酶抑制蛋白,并研究其对木聚糖酶的抑制作用,从而探明小麦中木聚糖酶抑制蛋白对外加木聚糖酶的影响。【方法】采用硫酸铵盐析、Macro-prep CM阳离子交换层析、Macro-prep DEAE阴离子交换层析以及Macro-prep 25S阳离子交换层析等方法,从小偃22小麦中分离纯化木聚糖酶抑制蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测木聚糖酶抑制蛋白的纯度和分子质量,并进一步研究了不同温度和反应时间对木聚糖酶抑制蛋白抑制活力的影响。【结果】小麦木聚糖酶抑制蛋白分子质量约为29ku,N端氨基酸序列为SVSSVVS,经NCBI BLAST比对,该抑制蛋白N端序列与其他木聚糖酶抑制蛋白无同源性,但与大麦几丁质酶的N端序列高度同源,却无几丁质酶活性;该蛋白对来自黑曲霉的GH11家族木聚糖酶有强烈的抑制活性,但对GH10家族的木聚糖酶不敏感;该蛋白与木聚糖酶结合的最适温度为30℃,最佳时间为30min;该抑制蛋白的半失活温度为74℃,具有较好的热稳定性。【结论】所获得的小麦木聚糖酶抑制蛋白可能是一种新型的XIP型木聚糖酶抑制蛋白。     

狐狸早期妊娠诊断初步研究

利用玫瑰花抑制实验,检测蓝狐妊娠前后免疫机能变化。以确定蓝狐孕血清中是否也存在早孕因子现象。为进一步研究狐狸的早孕检测方法提供基础资料。通过检测雌狐配种前后花抑滴度（ＲＩＴｓ）值。结果表明：怀孕动物与发情期、非妊娠动物的ＲＩＴｓ是有区别的。在实验中所检测发情期雌狐与未孕雌狐血清ＲＩＴｓ值均小于或等于１２,而妊娠雌狐血清ＲＩＴｓ值一般都在１８以上。据此,可以进行雌狐早期妊娠诊断。     

山羊早孕因子的测定及其特性的研究

怀孕小鼠血清花环抑制滴度显著地高于未孕鼠(p<0.01),说明怀孕血清中存在早孕因子.山羊血清经DEAE—纤维素柱层析、0.05molPBS液(pH7.0)洗脱,收集最初5ml洗脱液并用蔗糖进行浓缩,然后采用改良的小鼠脾细胞花环抑制实验对其花环抑制能力进行测定,结果发现怀孕山羊血清的花环抑制滴度显著地高于未孕山革、发情山革和公革(p<0.001),说明在怀孕山羊血清中也存在早孕因子.进一步研究发现在配种后24h时,山羊血清中即可测出早孕因子活性.而且,怀孕山羊血清早孕因子活性在配种后21天内维持在较高水平,结果提示血清早孕因子可做为山羊早孕诊断的指标.     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

血清β-HCG对异位妊娠保守性治疗效果判定的价值及其相关因素分析

目的:探讨血清-βHCG在输卵管妊娠保守性治疗后疗效观察的价值及其相关因素。方法:回顾性分析保守性治疗输卵管妊娠145例,其中药物治疗组62例(A组),单纯保守性手术38例(B组),保守性手术加术中输卵管局部注射甲氨蝶呤(M TX)10m g 45例(C组)。治疗后定期监测血清-βHCG变化并分析相关因素。结果:A组中保守治疗成功58例,4例保守治疗失败改手术治疗;B组36例治疗成功,2例发生持续异位妊娠;C组45例均治疗成功。C组术后血清-βHCG下降至正常时间明显短于A组和B组(P<0.01),B组则短于A组(P<0.01)。治疗前血清-βHCG浓度高者,行保守性手术(B、C组)治疗后降至正常所需时间长,但在A组中无明显相关性;各组停经天数、包块大小、腹腔内积血量均与治疗后血清-βHCG降至正常的时间无明显相关性。结论:连续监测血清-βHCG对异位妊娠保守性治疗后疗效观察及预防持续异位妊娠极为重要。手术中采用输卵管局部注射M TX可缩短术后血清-βHCG恢复至正常的时间。     

干扰素对附植前后哺乳动物妊娠识别与维持的作用

哺乳动物胚泡附植过程中能产生一种特异的妊娠相关蛋白——干扰素,它对妊娠的识别与维持十分重要。综述了绵羊、牛、猪、红鹿早期胚胎发育期间所产生的干扰素及其作用。     

腹腔镜下输卵管开窗取胚术联合局部注射MTX预防持续性异位妊娠的临床探讨

目的探讨输卵管妊娠行腹腔镜保守手术中使用甲氨喋呤(MTX)预防持续性异位妊娠的临床价值。方法对68例确诊为输卵管壶腹部妊娠的患者行腹腔镜开窗取胚术,将患者随机分为2组实验组(n=34)术中局部应用MTX20mg,对照组(n=34)局部注射等容量的生理盐水。于术前和术后d1、d4、d7、d10、d14查β-HCG及观察临床表现。结果2组术前一般情况和血β-HCG水平差异无显著性,但术后d1差异有显著性(P<0.05),术后d4、d7(P<0.01)和d10、d14(P<0.00)差异有极显著性。实验组无术后持续性异位妊娠(PEP),对照组出现6例术后PEP,二者差异有显著性(P<0.05)。结论在异位妊娠腹腔镜开窗取胚术中局部应用MTX可预防术后PEP的发生。     

前列腺素F_(2α)及其类似物终止黄牛妊娠的效果分析

10头妊娠3月龄左右的黄牛,分成3组。Ⅰ组4头,肌注国产前列腺素15甲基——PGF2a10ml,Ⅱ组2头,宫注氯前列烯醇500μg;Ⅲ组4头,肌注氯前列烯醇500μg。分别于给药时及前24、48h和后24、48、96、144h颈静脉采血10ml,用放射免疫法测定血浆孕酮水平变化。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组牛分别于给药后71.15±23.23、87.5±0.71和55.5±4.72h流产。组间比较,Ⅱ,Ⅲ组间差异显著(P<0.05)。血浆孕酮水平,给药后24h组分别由给药时的4.264±0.234、5.276±1.099和4.328ng/ml,下降到0.249±0.163、0.359+0.127和0.175ng/ml,前后差异极显著(P<0.01)。此外,除1头供试牛外,其它牛平均于流产后8.14±3.93天出现第—次发情。可见,用国产前列醇素甲基-PGF2a10mg和氯前列烯醇500μg宫注或肌注对妊娠3个月的黄牛可成功地引起流产。     

剖宫产术后子宫瘢痕处妊娠10例诊治分析

目的探讨剖宫产手术后子宫瘢痕处妊娠的病因、临床特征、治疗方法和预防措施.方法对10例剖宫产术后子宫瘢痕妊娠资料进行回顾性分析,对发病原因、诊断、治疗结果进行总结.结果 10例中有2例患者行子宫切除,8例患者保守治疗成功.结论剖宫产术后子宫切口瘢痕处妊娠可行保守治疗,对出血多、有生命危险的患者,则应行子宫切除术.     

正常妊娠妇女血清碱性磷酸酶的检测及其在不同孕期的参考值分析

目的:探讨正常妊娠妇女妊娠各期血清碱性磷酸酶(ALP)值的变化规律并分析其参考值范围。方法:采用日本A u-640型全自动生化分析仪检测400例早、中、晚期妊娠妇女(实验组)及56名未孕健康育龄妇女的血清ALP值(对照组)。结果:对照组血清ALP值为(67.2±19.8)U/L,早期妊娠时ALP为(47.2±15.1)U/L,比对照组明显降低(P<0.01);中期妊娠时ALP值为(68.7±21.2)U/L,与对照组比较差异无显著性(P>0.05);晚期妊娠时ALP值为(156.8±52.3)U/L,比对照组比较显著升高(P<0.01)。血清ALP值随孕周的增加而上升。结论:正常妊娠时,孕妇体内ALP值在早孕时降低,中孕时无明显变化,晚孕时快速升高,建议建立晚孕期ALP参考值范围,以利于孕期保健。     

输卵管妊娠三种保守疗法对患侧再通和再孕关系的探讨

目的：探讨输卵管妊娠3种保守疗法对患侧再通和再孕的关系。方法：对经治疗后随访3a的138例输卵管妊娠患者作分析。138例按治疗方法分3组．腹腔镜组（n=48开腹组（n=70）．药物组（n=20）。结果：患侧输卵管再通率：腹腔镜组为70．8％,开腹组为62．8％．药物组为25．0％（腹腔镜组vs开腹组P〉0．05;腹腔镜组和开腹组vs药物组P〈0．01）。宫内再孕率：腹腔镜组为62．5％．开腹组为54．3％．药物组为0．0％。（腹腔镜vs开腹组P〉0．05;腹腔镜和开腹组vs药物组,P〈0．01）。结论：输卵管妊娠行保守的腹腔镜手术和开腹手术的患侧的再通率和宫内再孕率显著高于药物保守疗法．但行保守的腹腔镜手术和开腹手术两者之间的患侧再通率和宫内再孕率差异无显著性（P〉0．05）．治疗后的妊娠率与治疗方式及对侧输卵管是否受损有关;保守输卵管复通术能替代输卵管切除术。     

正常孕妇红细胞铁蛋白含量的测定

采用放射免疫法测定了１２６例正常孕妇的红细胞铁蛋白含量。孕妇红细胞铁蛋白（６．９±６．４ａｇ／细胞）低于非孕妇女（９．７±７．３ａｇ／细胞），差异显著。红细胞铁蛋白含量不受妊娠期血容量增加等因素的影响，故能准确地反映孕妇体内的铁储备状况，对孕妇缺铁有较高诊断价值。     

受体牛黄体位置及黄体等级对胚胎移植效果的影响

为探索黄体等级和黄体位置对胚胎移植后受体牛妊娠率的影响,便于在应用中准确判断受体牛是否可以进行移植,整理、统计分析了137头移植受体牛的记录资料,结果表明:"2次PG"法和"CIDR PG"法处理受体牛,对形成黄体的等级没有影响;同期发情处理后,受体牛A、B、C级黄体的移植妊娠率分别为47.37%、42.86%和48.34%,黄体等级之间无明显差异(p>0.05);左、右侧黄体的妊娠率分别为43.63%和47.56%,移植时黄体存在的位置与移植妊娠率没有明显差异(p>0.05)。     

羊驼早期妊娠的B超诊断

[目的]建立羊驼早期妊娠B超检测技术,探索羊驼繁殖特性。[方法]选用5只健康、有正常分娩史的羊驼,进行早期妊娠的动态B超检测。[结果]妊娠20～30 d,胚囊明显可见,强回声胚体位于胚囊中后部,可见胚胎心跳;妊娠45 d,胚胎轮廓可见;妊娠90 d,胎儿轮廓清晰,胎动明显,羊水较多。[结论]建立了羊驼早期妊娠B超诊断方法。