茶树叶片氟亚细胞分布及其与细胞壁结合特性的研究

茶树具有较强的聚氟能力,叶片是主要聚集部位。为探讨茶树叶片聚氟的特性,分析了茶树叶片中氟的亚细胞分布,氟与细胞壁结合的可能方式。结果表明,3个品种茶树叶片中氟都主要分布于细胞壁(39.74%~56.49%),其次分布于可溶性组分(28.35%~37.32%)。果胶和半纤维素组分聚集了细胞壁90%以上的氟,是细胞壁富集氟的主要组分。细胞壁中的氟与Ca、Mn和Al等金属离子含量具有显著的正相关。甲基化和酯化处理能显著降低细胞壁中F、Mg、Fe、Ca、Mn、Al离子含量,而纤维素酶、果胶酶酶解处理对细胞壁中F、Fe、Ca、Mn、Al离子含量影响较小。说明细胞壁中-NH2和-COOH基团在氟与细胞壁结合中起着重要作用,而果胶和纤维素分子链的大小对结合氟影响不大。因此,茶树叶片细胞壁和可溶性组分是氟重要累积部位,二者的区隔化作用降低了氟毒害;氟可能与细胞壁中-OH、-NH_2和-COOH以氢键形式结合或者与细胞壁中金属离子以离子键结合而被固定在细胞壁中。     

茶树富集氟的特点及其机制的研究进展

茶树是一种超累积氟的植物,其体内的氟含量远远高于其他植物,却不表现氟中毒症状。氟不是茶树生长的必需元素,但在高氟胁迫下,氟可通过破坏茶树的细胞结构、抑制酶活性等影响其正常生长。通过阐述茶树吸收、富集氟及其累积/解毒机制等方面的研究进展,以期为未来研究茶树氟累积和降氟技术提供理论依据。     

茶叶中氟的浸出量与人体氟摄入量的关系

茶树是一种富集氟的植物,其叶片含氟量可高达n×10~2μg/,因此,通过饮茶摄入适量的氟是饮茶卫生的重要的一个方面。为此,我们研究了茶汤中茶叶氟的浸出量与茶叶冲泡时间以及与茶叶冲泡次数的关系。结果表明,茶叶氟的浸出量与茶叶冲泡时间之间呈显著的对数函数曲线相关,相关方程y=27.0+25.1logx;与茶叶冲泡次数之间呈显著的指数函数曲线相关,相关方程y=5.02e~(1.969)x~(-1)。     

茶树OSCA基因家族的鉴定及表达分析

钙通透性阳离子通道蛋白（OSCA）在植物调节高渗胁迫中发挥着重要作用。为了解OSCA基因家族在茶树响应干旱胁迫中的作用,本研究基于茶树全基因组数据对OSCA基因家族进行鉴定,分析CsOSCAs基因和蛋白结构以及启动子顺式作用元件,并对CsOSCAs在茶树不同组织、不同抗旱性品种间和干旱胁迫下的表达模式进行分析。结果表明：茶树基因组包含12个OSCA基因家族成员,分别命名为CsOSCA1～CsOSCA12;CsOSCAs基因编码的氨基酸序列长度为667～831 bp,蛋白分子量在76 630.55～93 563.99 kDa之间,等电点在6.15～9.33之间,含有9～12个跨膜结构域,均含有特征保守结构域DUF221,根据系统进化关系可以分为4个亚族;10个CsOSCAs基因定位于茶树7条染色体上,2个CsOSCAs基因定位于未锚定染色体的contig上;CsOSCAs基因编码的蛋白二级结构含有32%～38%的跨膜结构和60%～68%的α-螺旋;CsOSCAs基因具有组织表达特异性,CsOSCA2、CsOSCA3、CsOSCA11、CsOSCA12基因在干旱敏感的品种CN98中的表达量...     

茶树GGPS基因家族的克隆、生物信息学和表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)是萜类合成途径的结构酶,对植物生长发育具有重要意义。本研究通过RACE和RT-PCR方法克隆得到5条潜在的茶树GGPS序列,分别命名为CsGGPS1-4和CsGGPS9,其中CsGGPS9存在3条等位基因,分别是CsGGPS9-1、CsGGPS9-2和CsGGPS9-3,在系统进化树上与其他基因分成两支。蛋白质序列分析表明,茶树GGPS家族成员都具有polyprenyl_synt结构域,不存在信号肽序列。亚细胞定位预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4定位在叶绿体上,CsGGPS3和CsGGPS9定位在线粒体上。通过Swiss Model进行三维建模,结合"three-floor"模型对茶树GGPS家族成员的功能进行预测,预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4是GGPS;CsGGPS3是异源二聚体形式的牻牛儿基焦磷酸合酶的小亚基;CsGGPS9的催化主产物是碳链数大于30的异戊烯基焦磷酸。q RT-PCR分析表明,CsGGPS1整体表达丰度较低,仅在一芽二叶中表达量稍高;CsGGPS2在茶树各个组织中均有表达,在花中表达量最高,且花发育过程中表达量先上升后下降;CsGGPS3在叶和幼根中的表达量高于花,花发育过程中表达平稳;CsGGPS4在茶树各个组织中表达量数值相近,在花发育过程中表达量变化趋势与CsGGPS2相同;CsGGPS9的表达量在成熟叶中显著低于幼嫩叶片。     

茶树CLH基因家族的鉴定与转录调控研究及其在白化茶树中的表达分析

叶绿素酶（Chlorophyllase,CLH）是叶绿素降解过程中的关键酶,将叶绿素a脱去植醇,形成脱植基叶绿素a。以白化茶树白鸡冠新梢叶片为材料,克隆获得3条CsCLHs基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析。结果表明,3条CsCLHs基因分布于2个亚家族,其蛋白质编码区（Coding sequence,CDs）长度为894~975 bp,编码氨基酸个数为297~324,蛋白质分子量为31.99~34.91 kDa,等电点为4.89~7.61,不稳定系数为38.94~48.24,其中CsCLH1.1和CsCLH1.2为不稳定蛋白,CsCLH2为稳定蛋白。Cell-PLoc亚细胞定位预测结果表明,3个CsCLHs蛋白均定位于叶绿体;而WolfPsort亚细胞定位预测结果显示,CsCLH1.1和CsCLH1.2定位于细胞质,CsCLH2定位于叶绿体。遮阴和恢复光照处理下的qRT-PCR结果显示,遮阴抑制白鸡冠叶片CsCLHs的表达,光照诱导白鸡冠叶片CsCLHs的表达。不同品种中CsCLHs表达模式分析表明,CsCLH1s在白化叶中高表达。另外,酵母单杂交结果表明,CsCDF5可以与CsCLH1.1和CsCLH2启动子结合。综上所述,CsCLHs在白化茶树叶片中可能参与叶绿素降解,在叶片白化过程中发挥重要作用,结果可为进一步探究茶树CLH基因家族的功能及茶树叶片白化机理提供参考。     

茶树根系跨膜吸收氟的生理与分子机制

茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]是高富集氟的植物,氟在叶片中被大量累积。饮茶是人们摄取氟的重要途径,氟的过量摄入会影响人体健康。茶树主要通过根系从土壤中吸收富集氟,但是根系跨膜吸收氟的生理与分子机制尚不清楚。本文综述了茶树根系吸收氟的主动和被动途径,总结根系H+-ATPase和Ca^2+-ATPase介导氟的跨膜主动吸收过程与分子机制;剖析离子通道和Al-F络合在根系被动吸收氟过程中的作用及微观过程;分析影响根系吸收富集氟的主要因素及其调控措施。提出通过研究茶树根系氟跨膜吸收相关转运蛋白及其相关基因的克隆、表达和功能验证,以揭示跨膜吸收氟的分子机制;进而研究调控根系对氟的选择吸收,以保障茶叶质量安全和饮茶健康。     

玉米谷氨酰胺合成酶基因家族的生物信息学分析

谷氨酰胺合成酶(GS,EC6.3.1.2)是氮素代谢途径中的关键酶,对植物的生长和发育至关重要。采用多种生物信息学软件对6个玉米GS基因的可变剪接现象、核苷酸序列、编码蛋白序列、磷酸化位点、基因组结构、同源进化关系以及启动子顺式作用元件进行系统的生物信息学分析。结果表明,5个玉米GS基因存在可变剪接现象,编码蛋白的氨基酸数目为356~423个;6个玉米GS蛋白存在19~38个的磷酸化位点,各成员基因组序列上含有10~15个外显子;玉米GS基因可划分为GS2、GS1-1、GS1-2和GS1-3等4个亚组;6个基因定位到1、4、5、9和10号共5条染色体上,6个成员的启动子区域含有MYB结合位点、水杨酸响应元件和茉莉酸甲酯响应元件等重要的调控元件。     

茶树SRO基因家族的鉴定及表达分析

SROs(Similar to rcd one)是植物特有的基因家族。本研究利用生物信息学方法从茶树基因组中鉴定获得9个茶树SRO基因家族成员,分别命名为CsRCD1-4和CsSRO1-5。9个茶树SRO基因的编码蛋白均具有特征结构域PARP和RST,具有相似的保守基序。系统进化树分析聚分为3组,Ι组包含CsRCD1-4,Ⅱ组包含CsSRO1和CsSRO2,Ⅲ组包含CsSRO3-5。基因结构分析表明每个CsSRO基因含有4至9个外显子。8个茶树组织转录组数据分析表明,CsRCD1、CsRCD3和CsRCD4可能在茶树不同发育阶段具有重要作用;大多数CsSRO基因在根和成熟叶中较高表达。上游启动子区域分析发现大量与植物发育、激素及胁迫响应密切相关的顺式作用元件,进一步对CsSRO基因在干旱和脱落酸处理下的表达模式进行分析发现,9个CsSRO基因均被诱导表达,CsSRO基因可能与茶树抗旱密切相关。     

水培茶树对铅的吸收与累积特性研究

添加铅盐进行水培茶树试验,用火焰原子吸收光度法测定铅含量,研究茶树对铅的吸收、累积及分布特性。结果表明,铅离子能被根系或叶片大量吸收和累积,并按浓度差通过茎段转运与再分布;根施或叶部喷施2500mg/L的铅盐溶液,根系铅含量分别为8.00×10⁴mg/kg和8.38×10³mg/kg,叶片铅含量分别为551.79mg/kg和1.03×10⁴mg/kg,两者的铅富集量很高,但仍未见茶树死亡;当铅盐质量浓度为800~2000mg/L时,茶树逐渐受到铅危害,早期吸收根转为透明状,再褐变,后期叶片部分脱落;当铅盐质量浓度为300~800mg/L,水培茶树35d,茶树长势良好,未见受害症状。研究表明,水培茶树对铅具有大量吸收与累积的能力,并对铅危害有很强的抵抗与耐受力。     

茶树吸收富集氟的机制研究进展

茶树有聚氟特性,通常氟含量比其他植物高出几十倍,也不会表现受害症状。本文主要阐述了茶树吸收富集氟的特点,氟对茶树的生理影响及茶树吸收、富集氟机制的主要研究成果,并对茶树吸收富集氟的后续研究提出一些思考。     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

茶树Na+/H+逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ antiporter,NHX）在植物生长发育与逆境响应过程中扮演着重要角色。本研究以龙井长叶茶树品种为材料,克隆获得了茶树CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全长序列,GeneBank登录号分别为：MG722977和MG515211。生物信息学分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2的cDNA全长分别为1β691βbp和1β757βbp,均包含1个1β626βbp的开放阅读框,编码541个氨基酸,预测分子量为59.5βkD和59.7βkD,理论等电点为7.07和8.79;蛋白序列分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2属于典型的跨膜蛋白,均含有保守的Na⁺/H⁺ Exchanger结构域;进化树分析显示,CsNHX1和CsNHX2均为IC类中定位于液泡膜上的Class I成员。qRT-PCR结果显示,干旱、低温和盐胁迫能够显著诱导CsNHX1和CsNHX2上调表达;外源ABA处理下,CsNHX1和CsNHX2表达水平整体变化趋势不显著;高温胁迫处理下,茶树CsNHX1表达水平显著降低,而CsNHX2表达水平逐渐增加,表明茶树CsNHX1和CsNHX2参与了茶树对多种环境胁迫的响应过程,但对于不同逆境胁迫的应答模式存在一定差异。     

茶树CsCIPK12与CsKIN10的互作鉴定及其表达分析

蔗糖非酵解-1相关蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase,SnRK）在代谢调控和胁迫信号传递中发挥重要的作用。本文以茶树SnRK3亚家族的CsCIPK12基因和SnRK1亚家族的CsKIN10基因为研究对象,通过序列比对和进化分析,发现CsCIPK12和CsKIN10都具有N端激酶结构域和C端调节域;CsCIPK12具有与CBLs结合的NAF/FISL结构域,与拟南芥AtCIPK12,杨树PtCIPK17、18、19同源关系最近;而CsKIN10具有泛素相关的UBA结构域,与杨树PtSnRK1同源关系最近。通过酵母双杂交系统,证实了CsCIPK12和CsKIN10蛋白存在相互作用。表达分析发现,在自然冷驯化过程中,CsKIN10的表达模式与前期对CsCIPK12的研究结果一致,在龙井43、浙农12、大面白3个茶树品种中受低温不同程度地诱导;4℃短时低温处理发现,CsCIPK12和CsKIN10在成熟叶中受低温显著诱导（最高诱导水平分别为4倍和2.3倍）,而在新梢中,二者对低温的响应并不显著;ABA、葡萄糖以及蔗糖处理发现,CsCIPK12和CsKIN10在成熟叶中受这3种处理的显著诱导。结果表明,CsCIPK12与CsKIN10蛋白相互作用,参与ABA和糖信号途径,在茶树低温胁迫响应中可能发挥重要作用。     

茶树CsMYB基因启动子的克隆与功能分析

以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1β828βbp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1β038βbp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYB gDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch顺式作用元件、启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、逆境应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件,说明proMYB具有诱导型启动子特性,CsMYB基因在茶树植物体中可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号传导;通过烟草的瞬时表达结果表明,该启动子能驱动下游基因表达,具有启动子活性。     

茶树CsCML16基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

类钙调蛋白CMLs（CaM-like proteins）是植物体内一类重要的钙信号转导蛋白,在抗非生物胁迫中发挥重要作用。以龙井43、福鼎大白茶和黄金芽的一年生茶树扦插苗为材料,通过低温处理（10℃和4℃）分析茶树在低温胁迫下的生理变化;通过克隆茶树类钙调蛋白CsCML16,分析其在低温胁迫下不同抗寒性茶树品种中的表达模式。结果表明,低温胁迫下龙井43的抗寒性较强,福鼎大白茶次之,黄金芽品种较弱。以龙井43的cDNA为模板,克隆获得CsCML16基因,序列分析表明该基因CDS全长为480 bp,编码160个氨基酸,具有钙受体蛋白EF-Hand保守结构域,为小分子蛋白,相对分子量17.58 kDa;亚细胞定位结果显示CsCML16定位于细胞核和细胞膜。荧光定量结果表明,低温胁迫诱导CsCML16基因的上调表达,且在不同的茶树品种中表达量有差异。为进一步揭示CsCML16基因的生物学功能提供依据。     

茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。