茶树DNA去甲基化酶基因的全基因组鉴定及表达分析

DNA去甲基化酶（dMTase）是主动去甲基化过程中具有糖基化酶和脱嘌呤裂合酶活性的双功能酶。基于茶树基因组数据,本研究利用生物信息学方法对茶树DNA去甲基化酶（CsdMTase）编码基因进行了全面鉴定和序列分析。全基因组鉴定结果表明,舒茶早基因组中包含4个CsdMTases,系统进化分析将CsdMTases分为DME和ROS两个分支,基因结构分析显示不同成员之间的基因序列长度和内含子数量存在差异。不同CsdMTases蛋白的理化性质相似,均包含ENDO3c和RRM_DME典型的保守结构域,且都定位在细胞核中。CsdMTases家族基因启动子区域包含大量光信号响应、植物激素响应、胁迫响应和生长发育等相关顺式作用元件。表达分析结果显示,CsdMTase基因在不同组织器官中均有表达,有一定的组织特异性;在炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、拟盘多毛孢菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）和茶尺蠖（Ectropis oblique）等生物胁迫及干旱等非生物胁迫下,CsdMTase的表达均被显著诱导;冬季休眠过程中CsdMTases在不同品种成熟叶和越冬芽中的表达模式存在显著差异;CsDMEa、CsDMEb在花芽发育及种子萌发的不同阶段的表达存在显著上调过程。CsdMTases介导的主动去甲基化过程在调控茶树胁迫应答和生长发育中可能发挥了重要的作用,为深入揭示茶树表观调控机制提供理论依据。     

茶树Copine家族基因CsBON3的克隆与表达分析

Copine蛋白是一类包含2个C2(N端)和1个vWA(C端)保守域的Ca~(2+)依赖蛋白或磷脂结合蛋白,在胞内信号转导中发挥重要作用。基于序列相似性分析,从茶树转录组数据库中筛选出1条与Copine家族基因高度同源的EST序列。经测序验证该序列包含1 746 bp的完整ORF,编码581个氨基酸。同源比对显示该基因与拟南芥At BON3序列相似度最高(65%),将其命名为CsBON3(Gen Bank登录号为KY435900)。生物信息学分析显示,CsBON3蛋白分子量为63.66 k D,理论等电点为5.48;具有Copine家族蛋白特有的保守结构域;属亲水性蛋白,无信号肽位点,非分泌性蛋白,无跨膜结构域。表达分析表明,CsBON3在茶树花和根系中表达量最高,茎干和成熟叶中表达量最低。低温(4℃)处理茶树1 d后,其表达被显著上调;在生长阶段,该基因表达量高于休眠阶段;同时在接种炭疽菌的茶树叶片中,该基因也被快速上调,表明该基因可能与茶树低温、生长发育及抗病相关。     

茶树CsCIPK12与CsKIN10的互作鉴定及其表达分析

蔗糖非酵解-1相关蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase,SnRK）在代谢调控和胁迫信号传递中发挥重要的作用。本文以茶树SnRK3亚家族的CsCIPK12基因和SnRK1亚家族的CsKIN10基因为研究对象,通过序列比对和进化分析,发现CsCIPK12和CsKIN10都具有N端激酶结构域和C端调节域;CsCIPK12具有与CBLs结合的NAF/FISL结构域,与拟南芥AtCIPK12,杨树PtCIPK17、18、19同源关系最近;而CsKIN10具有泛素相关的UBA结构域,与杨树PtSnRK1同源关系最近。通过酵母双杂交系统,证实了CsCIPK12和CsKIN10蛋白存在相互作用。表达分析发现,在自然冷驯化过程中,CsKIN10的表达模式与前期对CsCIPK12的研究结果一致,在龙井43、浙农12、大面白3个茶树品种中受低温不同程度地诱导;4℃短时低温处理发现,CsCIPK12和CsKIN10在成熟叶中受低温显著诱导（最高诱导水平分别为4倍和2.3倍）,而在新梢中,二者对低温的响应并不显著;ABA、葡萄糖以及蔗糖处理发现,CsCIPK12和CsKIN10在成熟叶中受这3种处理的显著诱导。结果表明,CsCIPK12与CsKIN10蛋白相互作用,参与ABA和糖信号途径,在茶树低温胁迫响应中可能发挥重要作用。     

茶树硫酸盐转运蛋白基因CsSULTR3.1的克隆及其对硫和硒的响应分析

从茶树(Camellia sinensis)根系中克隆获得1条长度为1 999 bp的核酸序列,该序列包含1 980 bp的开放阅读框(ORF),编码659个氨基酸。BlastX同源性比对显示,该基因编码的氨基酸序列与葡萄VvSULTR3.1相似度最高(86%),将其命名为CsSULTR3.1(GenBank登录号:KY963793)。进一步分析显示,该基因编码的蛋白分子量为72.39 kD,理论等电点为7.61,属于非分泌性蛋白,包含10个跨膜结构域。以GFP作为标记进行亚细胞定位发现,该蛋白定位于细胞质中。qRT-PCR分析显示,CsSULTR3.1具有组织表达特异性,在茶树茎中表达量最高。CsSULTR3.1在茶树根系中的表达受Na_2SO_4和Na_2SeO_4诱导:60 mg·L~(-1) Na_2SO_4处理12 h后逐渐上调表达,在48 h时达到最大值,而240 mg·L-1Na_2SO_4处理12 h内显著下调表达,随后显著上调并维持相对稳定状态;在不同浓度Na_2SeO_4处理条件下表达量均呈现先降低后升高再降低的趋势,且均在48 h时达到最高。