应用聚合酶链反应快速检测沙门氏菌

根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物，对沙门氏菌属A－F各群中共15株沙门氏菌标准菌株、27株沙门氏菌现场分离菌株和其他10株非沙门氏菌菌株进行聚合酶链反应（PCR）扩增，结果沙门氏菌均出现495bp特异性DNA扩增条带，所有对照均未出现特异条带，提示这对引物具有很强的沙门氏菌属特异性。PCR敏感性试验显示，该体系能检出14pg以上的沙门氏菌DNA。通过对5种不同的DNA模板提取方法的比较，选择操作简便、快速、成本低廉的热裂解法。采用该方法。采用该方法，对生鲜奶样进行检测，经与国家标准卫生检验方法相比较，两者符合率达100％。     

沙门氏菌内标PCR快速检测试剂盒的研制与应用

 【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果。对食品样品的检测结果显示,阳性检出率为2/30,与国标法的检测结果相符,比未添加扩增内标的PCR检测结果（阳性检出率为1/30）准确。【结论】采用添加扩增内标的PCR试剂盒检测沙门氏菌,特异性强、灵敏度高、稳定性好,并能有效指示假阴性,提高检测的准确性,适用于食品中沙门氏菌的快速筛检。     

利用PCR技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)

根据玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartiisubsp.stewartii)ITS基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对玉米细菌性枯萎病菌和非玉米细菌性枯萎病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应.结果显示,玉米细菌性枯萎病菌的PCR产物出现301 bp的特异性扩增条带,而非玉米细菌性枯萎病菌均未出现扩增条带;其PCR检测的灵敏度为612 pg/μL.因此PCR技术是一种特异、灵敏、快速检测玉米细菌性枯萎病菌的方法.     

猪弓形虫特异PCR诊断方法的建立

[目的]建立特异PCR方法诊断猪弓形虫病.[方法]以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,优化PCR反应条件,对猪弓形虫分离株和临床病料进行检测.随机取阳性PCR扩增片段进行克隆,测序鉴定.[结果]在猪弓形虫分离株中PCR扩增出目的条带,且在肺门淋巴结和肠系膜淋巴结中扩增出特异性条带;PCR方法能检测到的最低DNA量为7.81 pg/μL;测序结果显示核苷酸序列与Genbank中已登录的猪弓形虫IST1基因序列相应部分序列完全相同.[结论]该PCR方法具有较高的敏感性和特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法.     

动物性食品源弓形菌23S rRNA基因PCR检测方法的建立

建立了一种快速、准确检测弓形菌(Arcobacter)的PCR方法。根据弓形菌23S rRNA基因序列设计引物,对弓形菌标准菌株、弓形菌食品分离株及非弓形菌属菌株进行PCR扩增。结果表明,弓形菌标准菌株和35株弓形菌食品分离株扩增后均可得到688 bp的目的条带,11株非弓形菌属菌株均未见任何扩增条带,对弓形菌的最低检测限为1.12×103CFU/mL。该方法操作简单、检测周期短、灵敏度高、特异性好,可用于食品中弓形菌的快速检测。     

猪链球菌EPF基因PCR检测方法的建立

根据已发表的猪链球菌EPF基因序列,设计一对特异性引物,以猪链球菌DNA为模板,进行PCR扩增,标准菌株、疑似病例分离菌株在预计的729bp位置上扩增出特异性条带,表明这套引物成功扩增出目的基因序列,但副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等的DNA样品都不能扩增出目的基因片段。结论本研究建立的PCR方法可以用于猪链球菌的检测。为猪链球菌病的诊断及分子流行病学的调查提供了新的手段。     

3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立

建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。     

浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立

根据大肠杆菌的β葡糖醛酸酶基因(uid)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc),分别设计3对特异性引物,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性以及扩增条件进行优化.结果表明:3对引物分别能扩增出147bp、570bp和280bp的特异性条带,反应条件优化后,3种目的菌在104 CFU/mL时均可同时扩增出较清晰条带(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在103 CFU/ml浓度下仍然可见到条带),仅沙门氏菌的检测比单基因PCR低一个稀释度,人工模拟果汁污染试验结果稳定.该方法操作简单、快速、特异性强,灵敏度高,能够实现对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种菌的快速诊断检测和生产过程监控.     

食品和动物性饲料中沙门氏菌PCR检测方法的建立

为建立食品及动物性饲料沙门氏菌的PCR快速检验方法,设计出一对特异性引物,分别对鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌以及多种非沙门氏菌的肠道病原菌进行了PCR扩增。结果,沙门氏菌出现300 bp的条带,其他非沙门氏菌无条带,证明该对引物特异性良好。利用人为污染沙门氏菌的方法,对鱼罐头、蛋制品、鱼粉、肉骨粉进行不同程度地沙门氏菌人为污染,对样品进行适当处理后进行PCR检测。结果,鱼罐头、鱼粉、蛋制品、肉骨粉均能达到理想检测效果,敏感性为10～100 CFU/50 L。利用该方法对商品鱼罐头、蛋制品、鱼粉、肉骨粉进行检测,具有检测速度快、特异性强、敏感性高等优点。     

半套式RT-PCR法检测腹泻延边黄牛血液伤寒沙门氏菌试验

为建立一种快速、特异性和实用性强、灵敏度高的沙门氏菌检测方法,参考GeneBank中登录号为U25631的沙门氏菌基因序列.设计并合成引物,组成半套式RT-PCR,扩增片段为581bp.应用该半套式RT-PCR对标准菌株伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、链球菌、巴氏杆菌和结核杆菌及临床伤寒分离出的沙门氏菌H1、H2株进行检测.并对延边地区牧场的产生-临床腹泻的延边黄牛血液中分离培养的不同菌株进行检测.结果表明,仪伤寒沙门氏菌标准株和临床一株样品在581bp处扩增出了特异的片段;该方法检测灵敏度为1 fg 核酸,且重复性好.说明此半套式RT-PCR法可以准确、灵敏、快速地检测出腹泻延边黄牛血液中的伤寒沙门氏菌.     

食品中克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)双重PCR检测方法研究

根据克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)16S rRNA基因以及局部大分子合成(MMS)操纵子特异序列设计2对引物,经反应体系和条件优化,建立了双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,Cronobacter spp.菌株PCR扩增均可见2条特异性条带,而其他菌株PCR扩增均为阴性。纯菌检测双重PCR的灵敏度为6.3×103 CFU.mL-1,而相对应单重PCR的灵敏度分别为6.3×101 CFU.mL-1和6.3×103 CFU.mL-1;人工污染的食品样品(奶粉、牛奶、鸡肉)在经过24 h增菌后,检测限均可达100 CFU.mL-1或100 CFU.g-1。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的条件下,双重PCR的检测限没有受到影响。表明本试验建立的双重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能克服食品样品基质及杂菌的干扰,可应用于食品中Cronobacter spp.的检测。     

利用Agilent 2100 Bioanalyzer检测食源致病性沙门氏菌

探讨Agilent 2100 Bioanalyzer芯片分析系统在检测食源致病性沙门氏菌的应用.根据致病性沙门氏菌的致病基因invA设计特异性引物扩增出致病性沙门氏菌特异性序列,然后分别用常规的琼脂糖电泳技术和Bioanalyzer对PCR产物进行检测,并比较两种检测方法的准确度、重复性和灵敏度.Bioanalyzer的准确度和重复性比琼脂糖凝胶电泳高,Bioanalyzer的准确度在95%以上,琼脂糖凝胶电泳仅为85%;Bioanalyzer的检测灵敏度也比琼脂糖凝胶电泳高.Bioanalyzer芯片分析系统结合PCR方法可对食源性致病菌进行特异、准确、稳定、灵敏的检测和鉴定,具有重要的推广价值.     

采用环介导等温扩增技术快速检测猪丹毒丝菌病原体

[目的]建立猪丹毒丝菌(E.rhusiopathiae)毒力株的快速检测方法.[方法]利用快速灵敏的环介导等温扩增技术( Loop - mediated Isotherml amplification,LAMP)针对丹毒丝菌spa基因较为保守区域设计4条特异性LAMP引物,采用FTA(Flinders technology associates,FTA)滤膜法提取12种血清型丹毒丝菌,8种非丹毒丝菌及受感染小鼠血液的基因组DNA,分析LAMP环引物的特异性;比较LAMP与传统PCR方法的扩增敏感性和产物特异性.[结果]在61℃恒温条件下,LAMP法能够特异性扩增丹毒丝菌特异条带,与常规PCR扩增结果一致;灵敏度实验表明LAMP法检测猪丹毒丝菌的检测下限为2 CFU/mL,较传统PCR的敏感性(大于20 CFU/mL)至少高10倍.LAMP方法与PCR方法都能在小鼠感染模型血样中检测到浓度为200CFU(10-7)/mL以上浓度的丹毒丝菌.[结论]LAMP法与FTA滤膜法相结合在检测丹毒丝菌中具有潜在的应用价值.     

鸡传染性贫血病PCR试剂盒技术的研究及应用

根据鸡传染性贫血病毒（CIAV）的VP1、VP2基因序列的结构特点,设计合成了一对引物,建立了检测鉴别鸡传染性贫血病毒PCR技术,并研制出CIAV—PCR检测试剂盒。试验结果显示,该CIAV—PCR检测试剂盒对参考菌株和地方分离株均能特异性地扩增出420bp条带,而对其他禽病病原体的扩增结果为阴性;该CIAV—PCR试剂盒最低能检测出10fg的CIAV DNA模板;保存期测定结果显示,在-20℃条件下保存至1、3．6、9个月时,试剂盒的敏感性无明显变化,仍能检测到10～100fg的CIAV DNA模板,保存至12个月时其敏感度虽然降低了1个滴度,但仍能100％检出人工感染鸡的临床样品。表明该CIAV—PCR检测试剂盒对CIAV临床样品的检测具有特异、敏感、快速和准确的特点,适合在临床生产中推广使用。     

链球菌通用PCR检测方法的建立及应用

为建立链球菌快速检测方法,根据链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成1对通用引物,对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测.结果表明,所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197 bp的特异性DNA条带,而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应;经对PCR产物进行测序分析表明,扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90%～98%;对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示,该PCR的最低检出量可达0.1 ng/mL;利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测,结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带,与传统生化鉴定结果符合率达到100%.这些结果表明,已成功建立了链球菌PCR检测方法,并可应用于临床链球菌的鉴定.     

肉品中两种致病菌的双重PCR快速检测技术的研究

[目的]建立一种同步检测肉品中金黄色葡萄球菌与沙门氏菌的双重聚合酶链式反应.[方法]采用7.5;氯化钠肉汤和GN增菌剂分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行增菌,根据金黄色葡萄球菌的femA基因与沙门氏菌的invA基因设计引物,通过PCR反应对目标基因进行扩增,并对反应体系进行优化.[结果]特异性实验显示引物特异性良好,经双重体外扩增体系优化显示条带清晰,无非特异性的扩增条带.[结论]双重PCR是一种灵敏度高的快捷检测方法,可为这两种致病菌的同时检出提供新途径.     

浦东地区部分畜禽养殖场沙门氏菌的分离鉴定

为了检测上海市浦东地区部分养殖场沙门氏菌阳性率,建立了沙门氏菌flim、invA、hns及hut基因四重PCR检测方法,对2014年03月至08月期间来自浦东地区患沙门氏菌的100份病、死猪禽内脏器官进行细菌分离、革兰氏染色、四重PCR鉴定及分离株flim基因序列分析。结果显示,浦东地区部分猪禽场沙门氏菌阳性率为23%(23/100);分离株flim基因序列与GenBank上已公布的沙门氏菌flim基因核苷酸同源性为98%~100%;进化树图谱表明,分离株flim基因与副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌亲缘性相近。     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。