斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3'非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 k D,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明,PmGDH的m RNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

斑节对虾谷氨酸脱氢酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)获得了斑节对虾(Penaeus monodon)谷氨酸脱氢酶基因(PmGDH)的cDNA序列。该序列全长2386 bp,开放阅读框(ORF)为1677 bp,3?非编码区(UTR)为688 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5?非编码区(UTR)为21 bp。ORF可编码558个氨基酸,预测分子量为61.837 kD,理论等电点为6.57。序列含有ELFV dehydrog N与NAD bind 1 Glu DH两个保守结构域,37个磷酸化位点,3个糖基化位点。通过同源性、相似性以及系统进化树分析,斑节对虾的GDH基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)GDH基因的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了PmGDH基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。结果表明, PmGDH的mRNA在各组织中都有表达,其中,在肌肉组织中表达量最高,其次为眼柄神经,在血淋巴与肠组织中表达量最低。96 h氨氮胁迫后,荧光定量PCR分析结果表明PmGDH在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比都具有显著差异(P<0.05),都具有不同程度的表达上调。表明PmGDH在氨氮代谢方面具有重要的作用,参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

斑节对虾Pellino基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

Pellino蛋白家族,是一类高度保守的E3泛素连接酶,在泛素化和先天性免疫中发挥重要作用。该研究通过RACE技术得到斑节对虾(Penaeus monodon)泛素连接酶Pellino基因的c DNA全长。该基因序列全长1 961 bp,编码区序列长1 299 bp,编码432个氨基酸,5’非编码区(UTR)为89 bp,3’UTR为573 bp。通过qRT-PCR技术,研究了PmPellino基因在斑节对虾不同组织中的表达水平,并研究了其在不同浓度氨氮胁迫下和不同微生物刺激下的表达情况。结果显示,PmPellino基因在各组织中均有表达,在鳃组织中表达量最高。急性氮氮胁迫后,PmPellino在肝胰腺中的表达量显著上调(P<0.01),但在鳃中的表达被抑制(P<0.01)。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著激活PmPellino在鳃中的表达,抑制其在肝胰腺中的表达。鳗弧菌(V. anguillarum)可显著抑制PmPellino在肝胰腺中的表达,而对PmPellino在鳃中的表达无显著影响。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可以显著激活PmPellino在肝胰腺和鳃中的表达。结果表明PmPellino可以激活免疫应答通路,在免疫防御中发挥重要作用。     

斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析

为了研究含硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase,SeGPx)在斑节对虾应激反应和卵巢发育中的作用,实验以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的Se-GPx基因(Pm Se-GPx)片段为基础,利用RACE技术获得Pm Se-GPx基因的c DNA全长,并对其进行了生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究了Pm Se-GPx在斑节对虾不同组织、卵巢发育各期、肝胰腺组织在pH9、硫酸铜(Cu~(2+))应激下的相对表达量和变化趋势。结果显示,Pm Se-GPx基因c DNA全长为959 bp,5'非编码区(UTR)长10bp,开放阅读框(ORF)长639 bp,编码212个氨基酸,310 bp的3'UTR包含一个硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),ORF中的密码子209TGA211编码硒代半胱氨酸(selenocysteine,U67)。实时定量PCR实验结果表明,Pm Se-GPx在斑节对虾的肝胰腺、卵巢、精巢、心脏等组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量显著高于其他组织,卵巢次之;卵巢发育阶段表达结果则显示Pm Se-GPx在卵巢发育各期均有表达,在卵巢Ⅲ期表达量最高,其次是V期;在Cu~(2+)胁迫下,其表达量总体呈现先下降后上升然后又下降的趋势;在环境pH为9胁迫下,表达趋势呈现先下降,后回升,然后又下降,再大幅上升的趋势。研究表明,SeGPx在斑节对虾卵巢发育过程中具有重要作用,且Se-GPx参与斑节对虾对环境理化因子应激的免疫调控。     

斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析

该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。研究结果表明,Pm GLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。     

氨氮胁迫下中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶基因的表达分析

采用 RACE 技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶 GDH 基因(FcGDH)。FcGDH 基因全长1779 bp,包括1个1659 bp 的开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸,预测分子量大小为61.3 kDa,理论等电点为6.54。同源性分析显示,FcGDH 氨基酸序列与其他动物高度保守,其中,与凡纳滨对虾最为相似,高达98%,其次为中华绒螯蟹,为89%。系统进化树分析显示,FcGDH 氨基酸序列与凡纳滨对虾 GDH 聚为一支,之后依次为：中华绒螯蟹、黑腹果蝇、埃及按蚊。组织表达分析发现,FcGDH 基因在肌肉、鳃、肝胰腺、胃、肠、淋巴和血淋巴中均有表达,其中,肌肉中表达量最高。氨氮胁迫后,FcGDH 基因在肌肉和肝胰腺组织中变化显著,在胁迫后期,FcGDH 基因表达量均上调,且与对照组相比差异显著(P<0.05),说明 FcGDH 基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因克隆及表达分析

应用RACE克隆技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国对虾p38 MAPK基因全长为1563 bp,开放阅读框长1098 bp,5'非编码区长122 bp,3'非编码区长343 bp,将该基因命名为Fcp38。氨基酸序列分析推测,该基因编码365个氨基酸,分子量为41.77 k Da,理论等电点为5.68。同源性分析表明,Fcp38基因与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38相似性最高,为98%。通过比对发现,该基因除含p38家族特有的标志性Thr-Gly-Tyr双磷酸化位点和底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp,还具有p38家族关键功能位点ED。系统进化分析显示,Fcp38与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38聚为一支。荧光定量PCR结果显示,Fcp38基因在肠、鳃、胃、心脏、淋巴、肝胰腺、肌肉、血细胞中均有表达,以在肌肉中表达量最高。氨氮胁迫后,该基因在中国对虾肌肉、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的相对表达量均显著增加,且有不同的时空表达趋势,表明Fcp38基因可能在中国对虾应对环境胁迫过程中起着重要作用。     

氨氮胁迫下中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶基因的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)谷氨酸脱氢酶GDH基因(Fc GDH)。Fc GDH基因全长1779 bp,包括1个1659 bp的开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸,预测分子量大小为61.3 k Da,理论等电点为6.54。同源性分析显示,Fc GDH氨基酸序列与其他动物高度保守,其中,与凡纳滨对虾最为相似,高达98%,其次为中华绒螯蟹,为89%。系统进化树分析显示,Fc GDH氨基酸序列与凡纳滨对虾GDH聚为一支,之后依次为:中华绒螯蟹、黑腹果蝇、埃及按蚊。组织表达分析发现,Fc GDH基因在肌肉、鳃、肝胰腺、胃、肠、淋巴和血淋巴中均有表达,其中,肌肉中表达量最高。氨氮胁迫后,Fc GDH基因在肌肉和肝胰腺组织中变化显著,在胁迫后期,Fc GDH基因表达量均上调,且与对照组相比差异显著(P0.05),说明Fc GDH基因在氨氮解毒代谢过程中发挥了重要作用。     

斑节对虾CDC42基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

细胞分裂周期蛋白42(CDC42)是一类广泛表达的小三磷酸鸟苷(GTP)酶,是Ras家族内Rho亚家族的成员之一,具有GTP酶活性。CDC42在细胞吞噬和炎症发生等先天免疫中发挥着不可替代的功能。该研究通过RACE技术克隆得到了斑节对虾(Penaeus monodon)细胞分裂周期蛋白42(Pm CDC42)基因c DNA全长。生物信息学分析结果表明Pm CDC42全长2 233 bp,包括59 bp的5'非编码区(UTR)、1 598 bp的3'UTR和576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸。通过实时定量PCR技术,研究了Pm CDC42在斑节对虾各组织的表达模式,并研究了其在不同p H、盐度、重金属镉(Cd)和哈维弧菌(Vibrio harveyi)胁迫下的表达情况。结果显示,Pm CDC42基因在各组织中均有表达,在血淋巴中的表达量最高。在p H和Cd胁迫下Pm CDC42表达量显著升高;在高盐胁迫下Pm CDC42表达量上调,低盐胁迫下Pm CDC42表达量变化不显著;在哈维弧菌的刺激下PmCDC42上调表达极显著。这表明Pm CDC42在斑节对虾先天免疫中起重要作用。     

斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),预测的分子量约为37.6 k D,理论等电点6.64。实时定量PCR显示其m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。     

中国明对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

利用RACE技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)天门冬氨酸转氨酶GOT基因(FcGOT)。FcGOT 基因cDNA全长为1 910 bp, 其中, 开放阅读框1 284 bp, 编码427个氨基酸。同源性分析表明, 中国明对虾天门冬氨酸转氨酶GOT氨基酸序列与其他节肢动物高度保守, 与克氏原螯虾(Procambarus clarkii) 和桔粉蚧壳虫 (Planococcus citri) 的同源性分别为78%和73%。系统进化分析表明, FcGOT基因氨基酸序列与克氏原螯虾GOT聚为一支。组织表达分析发现FcGOT基因在肝胰腺、鳃、血细胞、肌肉、心脏、淋巴中均有表达, 其中肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后, 荧光定量PCR分析结果表明, FcGOT基因在肝胰腺和鳃组织中的表达与对照组相比具有显著差异(P<0.05), 表明FcGOT基因在氨氮代谢方面具有重要的作用, 参与了中国明对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。

     

Response of facilitative glucose transporter 1 to salinity stress and dietary carbohydrate nutrition in white shrimp Litopenaeus vannamei

Facilitative glucose transporter 1 (GLUT1) is a transporter protein for glucose transport via the plasma membrane of the cells to provide energy through carbohydrate metabolism. GLUT1 cDNA from Litopenaeus vannamei was obtained and analysed in this study. Full‐length GLUT1 cDNA is 2062 bp long and contained a 1506‐bp ORF encoding a 502 amino acid protein, a 270‐bp 5′UTR and a 284‐bp 3′UTR. When shrimp were under acute low salinity stress, the expression in hepatopancreas, muscle, gill and eyestalk was all up‐regulated at 12 h (P < 0.05) and 96 h (P < 0.05), while the expression in the four tissues was all down‐regulated at 6 h (P < 0.05) and 48 h (P < 0.05) . The expression in the muscle of shrimp at water salinity of 3 was lower than that at water salinity of 30 independent of dietary carbohydrate levels, while expression in hepatopancreas, gill and eyestalk was up‐regulated at 200 and 300 g kg^?1 carbohydrate levels. The expression in all tissues fed glucose was up‐regulated when compared to the expression in shrimp held at a water salinity of 30. This study suggests that GLUT1 is a conserved protein in L. vannamei, and changes in expression due to environmental salinity and dietary carbohydrate level and source.     

企鹅珍珠贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析和应激表达研究

笔者初步研究了企鹅珍珠贝（Pteria penguin）组织蛋白酶D（cathepsin D,CTSD）的基因克隆和功能,通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得了企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因（命名为pgCTSD）。该基因cDNA全长1 767 bp,其中5＇UTR为38 bp,3＇UTR为553 bp,ORF为1 176 bp,编码392个氨基酸,包括信号肽（Met1-Ala18）、前体域（Leu19-Lys47）和成熟域（Tyr48-Ser392）三部分,分子量为42.3 kDa,等电点为8.04。pgCTSD氨基酸序列与大珠母贝（Pinctada maxima）pmCTSD的相似性最高（79%）,与其他物种的相似性为59%～75%。荧光定量分析表明,空白对照组中pgCTSD mRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,且在闭壳肌中表达量最少,肝胰脏中最高。与试验对照组相比,脂多糖（LPS）刺激6 h后性腺和肝胰脏显著下降,闭壳肌的表达量虽不大但增加显著,外套膜和鳃组织变化不显著;哈维弧菌（Vibrio harveyi）刺激6 h后肝胰腺和外套膜显著下降,闭壳肌和鳃显著上升,性腺无显著变化。肝胰腺中pgCTSD对LPS和弧菌刺激的应答反应表明pgCTSD可能参与了免疫反应。     

斑节对虾cyclin G2基因克隆及不同刺激下的表达分析

细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是细胞周期中的重要调控因子。该研究初步探讨斑节对虾(Penaeus monodon)细胞周期蛋白G2(Pmcyclin G2)在卵巢发育中的作用,利用RACE技术克隆获得4075bp Pmcyclin G2 c DNA全长,其开放阅读框(ORF)1161bp,编码386个氨基酸。利用荧光定量PCR技术研究了Pmcyclin G2组织表达模式,结果显示,Pmcyclin G2在斑节对虾的心脏、血淋巴、肝胰腺、卵巢等组织中均有表达,其中肌肉中表达量最高;卵巢发育不同阶段Pmcyclin G2的表达分析则表明,Pmcyclin G2在III期表达量最高;注射5-羟色胺(5-HT)能诱导卵巢Pmcyclin G2基因表达升高,多巴胺(DA)则抑制卵巢中Pmcyclin G2基因表达。利用原核表达技术获得了cyclin G2的体外重组蛋白,Western Blot分析证实重组蛋白为cyclin G2蛋白。此结果为进一步研究该蛋白的功能提供了条件。以上研究结果表明,Pmcyclin G2基因可能与斑节对虾卵母细胞发育有密切关系,该结果可为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供理论依据。     

斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析

研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(Pm Chi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因c DNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因c DNA全长2 050 bp,其中5'-非编码区(5'-UTR)144 bp、3'-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。     

Molecular and immune response characterizations of a novel Bax inhibitor-1 gene in pufferfish, <Emphasis Type="Italic">Takifugu obscurus</Emphasis>

Apoptosis plays a crucial role in many biological processes, including development, cellular homeostasis, and immune responses. Bax inhibitor-1 (BI-1) is an anti-apoptotic protein that protects cells from endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis. In this study, a BI-1 gene from the pufferfish Takifugu obscurus (Pf-BI-1) was identified and characterized. The full length of Pf-BI-1 cDNA was 1387 bp, including a 5′-UTR of 82 bp, a 3′-UTR of 591 bp containing a poly-(A) tail, and an open reading frame (ORF) of 714 bp that encodes a polypeptide of 237 amino acids. Pf-BI-1 was ubiquitously expressed in various tissues, with the highest expression levels in the blood, brain, and gill. The expression of Pf-BI-1 was up-regulated in a time-dependent manner after heat shock stress, ammonia stress, and bacterial challenge. Intracellular localization revealed that Pf-BI-1 was primarily localized in the cell cytoplasm. Furthermore, over-expression of Pf-BI-1 could active NF-кB reporter genes in HeLa cells. These results indicated that Pf-BI-1 may be involved in the apoptosis and immunity process against ambient stressors in pufferfish.     

瘤背石磺肌肉生长抑制素基因的克隆及组织表达分析

为探究石磺由海洋向陆地进化过程中肌肉生长和发育的分子机制,实验以石磺科贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全长并做了相应的组织表达分析。结果显示,瘤背石磺MSTN基因cDNA全长2667 bp,包括1650 bp的开放阅读框,374 bp的5′端非翻译区,643 bp的3'端非翻译区,共编码549个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质原子总量为8776,分子式为C2774H4331N783O862S26,分子质量约为63.27 ku,理论等电点为6.02,信号肽预测结果显示,N端具有21个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位点RSRR和C端多肽生物活性区以及9个保守的半胱氨酸残基。通过进化树分析,瘤背石磺MSTN与加州海兔MSTN的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MSTN基因在各个组织中均有表达;含肌纤维组织中的表达量低于内脏器官的表达量,在肝胰腺中的表达量最高,腹足表达量最低。MSTN基因一级结构具有很高的保守性,说明该基因在进化上的限制性和功能的重要性;同时该基因在石磺非肌肉组织中表达,表明该基因不仅有抑制肌肉生长的作用,还参与其他生命活动的调节。     

文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤C1q基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸。在文蛤C1q(MmC1q)蛋白中,C1q结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的C1q结构域均具有较高的同源性。通过荧光实时定量PCR,MmC1q mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高。在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,C1q相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmC1qmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍。包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmC1q重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性。