肉鸡肠源产细菌素乳酸菌的分离和鉴定

研究旨在从肉鸡肠道中筛选具有良好抑菌效果的产细菌素乳酸菌,并对其生物学特性和抑菌特性进行初步研究。试验采用牛津杯法,以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为指示菌,从饲喂菌丝霉素的肉鸡肠道分离筛选具有抑菌功能的乳酸菌。利用形态学、生理生化鉴定及16S rD-NA序列同源性分析进行菌种鉴定,通过热处理、过氧化氢酶、蛋白酶K处理确定抑菌活性物质,并绘制乳酸菌生长曲线及抑菌活性曲线。分离筛选到两株对大肠杆菌、沙门氏菌和金色葡萄球菌均具有较强抑菌活性的乳酸菌LAB12和LAB19,经鉴定菌株LAB12为乳酸片球菌,菌株LAB19为植物乳杆菌。过氧化氢酶处理不影响LAB12和LAB19抑菌活性,加热处理和蛋白酶K处理后抑菌活性减小。乳酸片球菌LAB12接种后2 h进入对数生长期,18 h左右进入稳定期,随着菌体数量增加发酵液上清抑菌作用增强,22 h抑菌活性达到最大且趋于稳定;植物乳杆菌LAB19在发酵2 h进入对数生长期,经约10 h快速生长后,生长速度趋于稳定,抑菌活性也基本保持不变。研究从饲喂菌丝霉素的肉鸡肠道中分离筛选到两株具有良好抑菌功能的乳酸菌,分别为乳酸片球菌LAB12和植物乳杆菌LAB19,初步鉴定这两株菌抑菌活性物质为细菌素。     

鸡源乳酸菌细菌素的分离筛选及鉴定

为了分离鉴定产乳酸菌细菌素,采用双层琼脂扩散法,对从健康鸡肠道内容物分离到的68株乳酸菌进行筛选,获得对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门菌均有抑制作用的17株乳酸菌,在排除酸、过氧化氢等因素作用后仍具有较强抑菌活性,表明发酵液中还有其他抑菌活性物质的存在,用蛋白酶处理上清液后有6株菌的抑菌效果消失,表明抑菌物质具有蛋白质性质,是一种细菌素类物质。筛选出的菌株所产抑菌物质是一种广谱细菌素,它们对革兰阳性菌和革兰阴性菌均具有较强抑制效果。结合形态鉴定、生理生化特性试验以及16S rRNA序列同源性分析鉴定菌株LABJN02、LABJN05、LABJN06和LABJN14分离菌为唾液乳杆菌,LABJN16为约氏乳杆菌,LABJN31为卷曲乳杆菌。细菌素作为潜在的抑菌物质,与其产生菌一起在平衡肠道菌群中具有重要意义。     

抑制黄曲霉乳酸菌的筛选与鉴定

黄曲霉是玉米(Zea mays L.)青贮过程的主要污染物之一，本研究旨在从玉米青贮饲料中分离筛选出能够抑制黄曲霉菌生长的乳酸菌，为改善和提高青贮饲料品质提供优良菌种。本试验采用双层平板法，从玉米青贮饲料中筛选抑制黄曲霉的菌株，并对其进行生理生化鉴定及同源性分析，构建系统发育树，明确各菌株的分类地位。结果表明：从青贮发酵不同阶段筛选得到50株乳酸菌，其中有7株乳酸菌对黄曲霉有明显抑制作用(P<0.05),抑菌圈直径均大于3.60 cm,均为革兰氏阳性同型发酵乳酸菌，7株乳酸菌中Q39(49.40%)和Q40(49.60%)抑菌效果最好，抑菌圈直径为4.15 cm和4.17 cm,显著高于其他5株乳酸菌(P<0.05);菌株Q11,Q28,Q40,Q44与22种碳水化合物作用均呈阳性，菌株Q39和Q49与鼠李糖作用呈阴性，与松三糖反应呈弱阳性，菌株Q13相较于其他6株菌株对于碳源的利用情况较弱；经16S rDNA鉴定确定菌株Q39和Q49为植物乳杆菌，Q11,Q13,Q29,Q40,Q44为戊糖乳杆菌。菌株Q39和Q40可作为全株玉米青贮发酵的备选添加菌株。     

高抗菌活性乳酸菌的筛选及菌种鉴定

研究旨在筛选适用于饲料青贮的高抗菌活性乳酸菌，并进行菌种鉴定。以藤黄微球菌、沙门氏菌、大肠杆菌为指示菌，通过牛津杯双层平板法对从玉米、水稻、蔬菜残渣、猪粪、鸡粪等样品中分离出的121株乳酸菌进行抑菌试验。通过生理生化，碳源发酵试验和16S rRNA分子鉴定及recA基因扩增对所选菌株进行鉴定。菌株ZZU 575具有较强抗菌活性，排除酸、过氧化氢干扰后，其发酵上清液对大肠杆菌抑制作用消失，但对藤黄微球菌及沙门氏菌仍有很强的抑制活性；其抑菌活性在酸性条件下较强，在加入蛋白酶K和胰蛋白酶以及100℃以上热处理时明显下降甚至消失；ZZU 575被鉴定为植物乳杆菌。菌株ZZU 575在饲料青贮中具有潜在应用价值。     

虾源罗伊氏黏液乳杆菌的分离鉴定及其性质研究

本试验旨筛选一株防治水产致病菌能力强的虾源乳酸菌,并对其抑制水产致病菌的性质进行研究。以健康南美白对虾的不同肠段菌群为菌株分离来源,采用CaCO3-MRS固体培养基分离纯化乳酸菌,再通过抑菌能力试验和溶血试验复筛获得安全菌株。对筛选的乳酸菌菌株进行16S rRNA测序鉴定,并评价其生长特性、耐受性、抗生素敏感性及不同处理的发酵上清液对水产病原菌的抑菌能力。结果显示：对常见水产致病菌抑菌能力最强的安全菌株经16S rRNA测序鉴定为罗伊氏黏液乳杆菌SAMMRS-1G。在菌株的生长特性上,罗伊氏黏液乳杆菌SAMMRS-1G的最适培养pH为5.0,最适培养温度为39℃,4～14 h为其对数生长期;从耐受性上看,罗伊氏黏液乳杆菌SAMMRS-1G对人工胃肠液和渗透压均具有一定的耐受性,在pH 3.0条件下静置培养4 h存活率为90.7%,3.0 g/L的胆盐浓度下培养4 h存活率为85.3%,60‰高盐度条件下静置培养4 h存活率为98.7%;在不同处理对罗伊氏黏液乳杆菌SAMMRS-1G发酵上清液抑菌能力影响方面,发酵上清液对致病菌的抑菌能力为创伤弧菌>金黄色葡萄球菌>副溶血弧菌...     

一株牛源嗜酸性乳杆菌体外抑菌试验研究

为了验证微生态活菌制剂候选菌株的益生特性,将筛选出的牛源嗜酸性乳杆菌NL0908进行体外抑菌试验,通过共培养和上清液抑菌试验,分析发现,菌株NL0908对病原菌大肠杆菌有较强的抑菌作用。将其上清液进行相应的热处理、蛋白酶处理、中和酸等,结果表明,其抑菌物质主要是由有机酸和抗菌小肽物质共同作用。     

健康动物肠道源产窄谱细菌素乳酸菌的筛选鉴定

从健康猪、鸡、兔新鲜粪便及鸡肠道内容物等78份样品中分离乳酸菌,以大肠杆菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌筛选有明显抑菌活性的菌株,同时进行产细菌素的乳酸菌筛选,并测定抑菌谱;进一步通过生化试验,并结合16S rRNA基因测序结果确定菌株的种类,采用溶血试验和动物试验确定分离菌株的安全性。结果表明,在分离得到的30株乳酸菌中,共有8株对指示菌有抑制作用,其中1株为产窄谱细菌素的短乳杆菌。本研究为下一步探讨产细菌素短乳杆菌作为天然防腐剂和抗菌剂提供了材料。     

来源于马奶酒中一株乳酸菌的抑菌特性研究

从牧民自制马奶酒中分离得到一株能产生抑菌物质的乳酸菌菌株。依据形态学判断、生理生化、糖发酵试验和16S r DNA序列分析,结果表明该菌为一株植物乳杆菌。抑菌试验结果表明该菌株的培养液可抑制藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌等致病菌,具有较广的抑菌谱。该乳酸菌分泌的抑菌物质经不同高温处理后仍有85%抑菌活性,经蛋白酶处理后抑菌活性依然存在,说明该菌株产生的抑菌物质具有良好的热稳定性和抗蛋白酶活性,这些特性也为其作为益生素在食品和饲料行业中应用奠定基础。     

植物乳杆菌抑菌蛋白的分离鉴定及抑菌特性研究

【目的】筛选新型广谱有效的抑菌蛋白,为全面解析植物乳杆菌抑菌机制和开发新型抗菌制剂奠定基础。【方法】以植物乳杆菌GX20200417-1为研究对象,采用牛津杯法测定其抑菌活性,以低温离心和超滤法初步分离获得胞外蛋白并测定其抑菌活性,对胞外蛋白进行不同温度、pH及蛋白酶处理,研究抑菌蛋白理化特性,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进一步分析鉴定植物乳杆菌代谢产物中的抑菌成分。【结果】植物乳杆菌GX20200417-1对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌作用;发酵上清液在发酵24 h的抑菌能力最强;胞外蛋白的抑菌能力与发酵上清液相近;植物乳杆菌抑菌蛋白具有较好的耐热特性,与对照组相比,在20~80 ℃时抑菌活性均无显著变化(P＜0.05),在pH 6.0~8.0时抑菌活性最佳,对蛋白酶敏感;经LC-MS/MS鉴定分析,检测出5种可信度较高且与抑菌作用相关的蛋白质,分别是片球菌素pediocin PA-1、溶菌素(lysin)、聚酮合酶(polyketide synthase)、辅助蛋白(accessory protein)和LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein,分子质量分别为5.348、7.348、8.348、6.348和19.662 ku;蛋白质功能分析结果表明,片球菌素pediocin PA-1与溶菌素主要通过破坏细菌细胞壁与细胞膜,从而达到抑菌效果。LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein可识别含有N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的肽聚糖,上调抗菌肽的表达;辅助蛋白主要参与细菌素的合成,聚酮合酶主要参与抗生素的合成,二者通过参与抑菌物质的合成间接发挥抑菌作用。【结论】本研究成功分离并鉴定植物乳杆菌GX20200417-1的5种抑菌蛋白;植物乳杆菌GX20200417-1可能通过其代谢产物中的多种抑菌蛋白协同发挥抗菌作用。     

健康奶牛生殖道乳酸菌的分离鉴定及其抑菌活性研究

【目的】 从健康奶牛生殖道分离筛选益生乳酸菌,为未来防治奶牛子宫内膜炎提供益生菌菌株并为开发防治此病的微生态制剂奠定基础。【方法】 采集10份健康奶牛的生殖道分泌物样品,用MRS培养基进行分离培养,通过形态学观察和16S rDNA序列对分离出的菌株进行鉴定,将所得序列结果与NCBI核酸数据库参考菌株进行相似性比对,确定各分离菌株的种属。利用牛津杯法分离筛选出具有较好抑菌活性的菌株,研究这些筛选出的菌株的生长曲线、产酸能力及抗菌药敏感性,并对其主要抗菌物质进行检测。【结果】 从10个样品中共分离出13株乳酸菌,经染色镜检和16S rDNA测序分析鉴定出13株乳酸菌,分别为植物乳杆菌11株、殊异肠球菌和鼠肠球菌各1株。单株抑菌试验得到5株对大肠杆菌抑菌能力较好的乳酸菌,5株乳酸菌生长特性及产酸能力均良好,对氨苄西林、四环素、红霉素、利福平、甲氧苄啶、氯霉素和青霉素7种抗菌药物敏感性较强。其中21和35号菌株的抗菌物质为过氧化氢和细菌素,而25、33和34号菌株的抗菌物质除过氧化氢和细菌素外还包括有机酸。【结论】 从奶牛生殖道中分离得到的3株乳酸菌有望作为微生态制剂用于奶牛子宫内膜炎的临床防治,其具体防治效果有待进一步探究。     

苜蓿青贮乳酸菌的筛选及其对苜蓿青贮发酵的影响

为获得苜蓿青贮用乳酸菌,本研究从苜蓿附生乳酸菌中通过抑菌活性、酸化苜蓿粉及结构性糖代谢中间产物的性能指标筛选优良菌株,并研究其对苜蓿(Medicago sativa)青贮发酵的影响。结果表明,1)筛选到抑菌活性较高、酸化苜蓿粉及结构性糖代谢中间产物综合性能较好的菌株ZZU A341,被鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum);2)青贮90 d,添加该菌株的处理组pH、氨态氮含量低于添加商业菌株(YX)的处理组,显著低于自然青贮(P<0.05)。综上所述,使用该筛选方法获得的优良乳酸菌可有效改善苜蓿发酵品质。     

优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响

为了探讨乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量及其pH的影响,进一步筛选出可提高青贮饲料品质和有氧稳定性的乳酸菌接种剂,将实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离筛选获得的5株产酸快、多且具有抑菌活性的优良乳酸菌分别添加全株玉米进行青贮,分析青贮过程和有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量的动态变化及pH。结果显示,在青贮过程和有氧暴露后,分别添加肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳杆菌B3-1、屎肠球菌B5-2和发酵乳杆菌E2-3的各处理组乳酸菌总数均显著高于对照组,而好氧细菌、酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组,pH亦低于对照组。其中B1-7和B5-2处理组在青贮初期乳酸菌总数最多,从青贮第7天开始到有氧暴露的30 d内,始终是B3-1处理组乳酸菌总数最多,好氧细菌、酵母菌和霉菌数量最少、pH最低。以上结果表明这5株乳酸菌具有提高青贮饲料品质和有氧稳定性的潜力,其中植物乳杆菌B3-1的效果最好。     

小花棘豆与玉米混贮微生物特性及脱除苦马豆素乳酸菌的筛选

旨在探讨小花棘豆与玉米按不同比例混贮对微生物特性及乳酸菌多样性影响,挖掘具有脱除苦马豆素活性的乳酸菌,为小花棘豆青贮饲料的开发利用提供理论参考。以小花棘豆和全株玉米为原料,按不同比例10:0(T₁)、9:1(T₂)、8:2(T₃)7:3(T₄)、6:4(T₅)、5:5(T₆)、4:6(T₇)、0:10(T₈)混合青贮,室温发酵60 d,检测青贮前、后微生物种类、数量变化,鉴定分离出的乳酸菌,并测定其对苦马豆素的脱除率。试验结果:1)原料中乳酸菌数量随着玉米混入量的增加逐渐升高,青贮饲料各处理间乳酸菌数量无显著差异;原料中的肠细菌各处理间无显著差异,经过青贮发酵后肠细菌均未检测到;好氧细菌数量在原料和青贮饲料中均随着玉米比例的增加逐渐减少;酵母菌数量在各处理间均无显著差异;原料中的霉菌数量随着玉米混入比例增加逐渐增加,而青贮饲料中的霉菌数量均在检出线以下。2)从小花棘豆与玉米混贮的原料中共分离得到乳酸菌菌株4株,经鉴定属于Lactococcus lactis subsp. hordniae、Lactococcus lactis subsp. lactis和Lactococcus taiwanensis 3种;从青贮饲料中分离出乳酸菌菌株9株,经鉴定属于Lactobacillus plantarum subsp. plantarum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus pentosus和Lactobacillus amylovorus 4种,当玉米混入比例升高时,原料中乳酸菌多样性有所增加,而青贮饲料中乳酸菌多样性有所下降。3)不同乳酸菌菌株对苦马豆素的脱除率均高于85%,其中菌株JD6E、JD4D、JD10D、JD2E和JD1F对苦马豆素的脱除率高达100%。经过热处理后,菌株JD10D和JD2E对苦马豆素的脱除率分别为100%和97.76%,而其他菌株对苦马豆素的脱除率下降31.76%~100%,其中菌株JD6D和JD1E经过热处理后对苦马豆素的脱除率分别下降到2.17%和0。结果表明,小花棘豆与玉米混贮可以增加青贮原料中乳酸菌的数量及多样性,降低青贮饲料和原料中好氧细菌的数量,有助于提高青贮成功率;乳酸菌对苦马豆素具有良好的脱除效果,菌株JD10D和JD2E对苦马豆素的吸附脱除作用最强,而菌株JD6D和JD1E对苦马豆素的降解作用最强,均可用作小花棘豆青贮脱除苦马豆素的发酵菌株。     

苜蓿青贮优势菌种筛选及应用效果

本试验旨在筛选自然发酵苜蓿青贮的优势菌种,应用于高水分苜蓿青贮的调制,研究不同微生物及组合对高水分苜蓿青贮品质的影响。试验先调制自然发酵苜蓿,青贮30 d后,从中筛选优势菌种并进行鉴定。根据优势菌种筛选结果,组合了9组发酵菌种用于苜蓿青贮的调制,分别为:以植物乳杆菌与乳酸片球菌为发酵菌种,活菌数比例分别为1∶1、1∶2和2∶1,编号为1、2、3组;以植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌为发酵菌种,活菌数比例分别为2∶1∶1、1∶1∶1和4∶1∶1,编号为4、5、6组;以植物乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌和乳酸片球菌为发酵菌种,活菌数比例分别为2∶1∶1、1∶1∶1和4∶1∶1,编号为7、8、9组;以不加任何菌种的自然苜蓿青贮作为对照。每组3个重复,发酵60 d后,对苜蓿青贮进行感官评定,并测定氨态氮/总氮(NH3-N/TN)、总酸含量和pH。结果表明:用MRS、LB和NA 3种培养基从自然发酵苜蓿青贮中筛选到微生物菌种31株,对其中18株进行了分子鉴定,主要菌种为植物乳杆菌9株、乳酸片球菌1株、粪肠球菌2株、各种芽孢杆菌6株。感官评分结果表明乳酸菌(植物乳杆菌和乳酸片球菌)比例大的各组评分等级显著高于对照组和添加了添加枯草芽孢杆菌的各组(P<0.05)。对于NH3-N/TN、总酸含量和pH等指标,乳酸菌比例较低的2、5、8和对照组与其余各组差异显著(P<0.05)。综上所述,植物乳杆菌和乳酸片球菌是苜蓿青贮主要菌种,用于苜蓿青贮有利于青贮品质的提高。枯草芽孢杆菌会影响苜蓿青贮的气味,解淀粉芽孢杆菌为菌种会改善苜蓿青贮风味,但比例太高会增加NH3-N含量。     

发酵饲料中抑菌菌种筛选及抑菌性能评估方法的初步研究

试验通过牛津杯法筛选出抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌性能较强的一株乳酸菌L3和两株芽孢杆菌D9、K9。将其用于制作发酵饲料,提升发酵饲料的抑菌性能。试验初步研究发酵饲料的体外抑菌性能评估方法。结果表明,用80%的乙醇溶液作为发酵饲料的前提取溶剂可增加抑菌物质的溶解,浓缩提取液的浓度可使发酵样品的抑菌效果更加明显。     

单一和复合乳酸菌添加剂对扁穗牛鞭草青贮品质的影响

利用实验室前期筛出的3株耐高温乳酸菌作为添加剂,探究单一和复合乳酸菌添加剂对高温高湿地区扁穗牛鞭草青贮品质的影响,进一步筛选出最佳的乳酸菌添加配比。试验设8个处理,分别为:1)戊糖片球菌(PP04);2)食窦魏斯氏菌(WC10);3)植物乳杆菌(LP694);4)M-1(PP04∶WC10=2∶1);5)M-2(PP04∶LP694=1∶2);6)M-3(WC10∶LP694=2∶1);7)M-4(PP04∶WC10∶LP694=2∶1∶1);8)CK(对照,无乳酸菌添加)。青贮60 d后,测定其发酵品质、营养成分及微生物组成,结果表明:1)处理组的NH3-N/TN显著低于对照组(P<0.05);2)处理组的乳酸、干物质含量和干物质回收率都显著高于对照组(P<0.05);3)处理组的pH值都小于4.2,其中,M-4处理组的pH值最低,为3.86;4)M-4处理组的微生物菌群组成和感官品质优于其他处理,乳酸含量最高,NH3-N/TN最低。因此,在扁穗牛鞭草青贮中添加单一或者复合乳酸菌均有利于调制出优质的扁穗牛鞭草青贮饲料,3种乳酸菌复合添加的M-4处理组改善青贮饲料的青贮品质的效果最佳,在生产实践中具有推广利用的潜质。     

苜蓿青贮饲料中优良乳酸菌菌株的筛选

本研究从苜蓿（Medicago sativa L.）青贮饲料中分离得到若干株乳酸菌,对所有菌株进行生长曲线和产酸速率测定,发现其中8个菌株产酸速率较快,能于24h内将培养基pH值降至4.0以下。根据形态、生化鉴定及16S rDNA同源性序列分析,鉴定4株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,2株为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）,1株为类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum）,1株为副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）。通过适当的工艺处理其有望作为乳酸菌添加剂单独或混合添加入青贮中以提高青贮饲料品质。     

植物乳杆菌、布氏乳杆菌对甘蔗尾青贮品质及有氧稳定性的影响

为了研究植物乳杆菌、布氏乳杆菌对甘蔗尾青贮品质及有氧稳定性的影响。试验共分为10组,A组为对照组,添加生理盐水;B、C、D组为植物乳杆菌添加组,分别在新鲜甘蔗尾中添加10、20和30 mL/kg植物乳杆菌液;E、F、G组为布氏乳杆菌添加组,在新鲜甘蔗尾中分别添加10、20和30 mL/kg布氏乳杆菌液;H、I、J组为植物乳杆菌、布氏乳杆菌联合添加组,在新鲜甘蔗尾中分别添加10、20和30 mL/kg布氏乳杆菌和植物乳杆菌等体积混合的菌液。每组3个重复。室温青贮40 d,结束后采样测定青贮发酵品质和有氧稳定性。结果显示：与对照组相比,添加植物乳杆菌组降低了甘蔗尾青贮pH,显著增加乳酸含量（P<0.05）,且随着植物乳杆菌添加量的升高而升高。与添加植物乳杆菌相比,添加布氏乳杆菌组甘蔗尾青贮中乳酸含量显著降低（P<0.05）,乙酸含量显著升高（P<0.05）,且均随着布氏乳杆菌添加量的提高效果更显著;添加布氏乳杆菌组甘蔗尾青贮有氧稳定性较对照组提高48 h。布氏乳杆菌和植物乳杆菌联合组甘蔗尾青贮中乳酸含量显著高于对照组（P<0.05）,且干物质损失较单独添加布氏乳杆菌组有所降低,且能够提高青贮可溶性碳水化合物（WSC）利用效率。综上所述,植物乳杆菌与布氏乳杆菌联合处理（添加量达到2×10⁶ CFU/g鲜重,I组）青贮甘蔗尾能够有效提高青贮品质和有氧稳定性。