常压室温等离子诱变选育高产橙、黄色素红曲菌研究

为了提高红曲菌(Monascus sp.)产橙、黄色素的性能,采用新型的常压室温等离子体(ARTP)诱变技术处理红曲菌WM951孢子悬液。结果表明,最佳照射时间为90 s,此时红曲菌突变效果最好,其孢子致死率为78%,形态突变率为14.2%。试验最终从15株突变菌株筛选得到1株高产橙、黄色素的突变菌株WM951M1,对该菌株的发酵产物进行色价检测分析,发现该突变菌株产橙、黄色素能力比出发菌株分别提高136%、43%,30℃培养10d后其固态发酵红曲米中橙、黄色素色价最大值分别为3 620、3300 U·g-1。出发菌和突变菌所产色素的全波长扫面图谱显示,突变菌所产色素最大吸收峰出现在465nm处,并在410 nm处也有吸收峰,说明该菌主要合成橙、黄色素。在传代培养的过程中,该突变菌株表现出良好的遗传稳定性及形态稳定性,不仅可应用于生产橙、黄色素,也可用于生产色调偏橙型红曲米,还能丰富红曲菌菌株库资源。     

桔青霉形态分化与核酸酶P1产量突变关系研究

桔青霉（Penicillium citrinum）CICC 4011菌株经60Coγ射线诱变以及多菌株连续多轮原生质体融合后,变异株产核酸酶P1能力与形态性状出现了较大差异。研究表明黄绿色或灰绿色菌落产酶水平较高,绿色或艾绿色菌株产酶水平较低。选择不同产色特征的变异株（J1Y6、 F-13、F-R-33）与CICC 4011进行比较,表明4株桔青霉生长速度没有明显差异。融合子F-R-33菌落呈深艾绿色,产水溶性红色素,核酸酶P1低产（23.1U/ml）;诱变菌株J1Y6菌落呈黄绿色,产水溶性黄绿色素,核酸酶活较高（167.3U/ml）;融合子F-13菌落呈灰绿色,不产水溶性色素,核酸酶活较高（578.6U/ml）。电镜观察发现J1Y6、F-13分生孢子梗上帚状分枝减少,菌丝生长粗壮,产孢能力不及4011及F-R-33。核酸酶P1和色素虽然都是次级代谢产物,但核酸酶P1的合成明显与生长相关,而色素的合成则表现出非相关性。突变株RAPD-DNA多态性检测率为70%。UPGMA聚类分析,菌株F-R-33与出发菌株4011聚为一类（相似系数0.9）,核酸酶P1高产菌株J1Y6和F-13聚为一类,高产与低产突变株的DNA多态性表现出明显差异（相似系数0.8）。     

木霉的空间诱变效应

本文对产纤维素酶的木霉菌孢子和斜面培养菌体搭载中国第18颗返回式卫星后,菌落形态和产酶能力的变化进行了研究。实验结果表明,搭载菌株的菌落形态发生变异,菌株的生长周期出现了缩短或延长的现象。对搭载的木霉菌株进行筛选,获得3株产酶能力大幅度提高的优良突变菌株,产酶能力提高了50%以上,且性状遗传稳定。     

肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响

以pSET152和pHL212为出发质粒，通过供体大肠杆菌ET12567（pUZ8002）和S17-1属间接合转移肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis），首次构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。利用PCR介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌nsdA基因 （negative regulator of Streptomyces differentiation）中断载体，通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株BIB2005，筛选得到一株遗传稳定表型为AmR、KmS的接合子BIB309。PCR分析结果显示该接合子即为nsdA中断突变株。与出发工业菌株相比，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。     

变铅青链霉菌66的多效性突变子

变铅青链霉菌ＤＮＡ存在一种异常的位点特异性修饰，使其在含有Ｆｅ＾２＋的电泳缓冲液中电泳时遭到双链切割。用ＮＴＧ诱变变铅青链霉菌ＪＴ４６，获得了一株修饰缺陷突变株，命名为ＺＸ１。该突变菌株除了丧失修饰其ＤＮＡ的能力以外（亦即其ＤＮＡ在含有Ｆｅ＾２＋的电泳缓冲液中电泳时不被降解），在某些基因［如黑色素基因（ｍｅｌ）和某些抗生素抗性基因］的表达方面也发生了变化，同时还丧失了产孢能力和对唾噬体ΦＨＡＵ３的     

瑞氏木霉碳源阻遏相关基因Cre1的分子改造

为了提高瑞氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶的活力,用类似基因改组的方法改造其碳源阻遏相关基因cre1。以瑞氏木霉基因组DNA为模板PCR扩增cre1基因,用DNaseⅠ消化cre1基因后,回收50-100 bp的DNA片段,用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行无引物PCR,并将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,通过测定滤纸酶活的方法筛选突变菌株,并在NCBI上比对分析突变菌株的cre1基因。结果表明,筛选获得1株纤维素滤纸酶活比出发菌株提高0.7倍的突变菌株cre2-3。cre2-3菌株在液体培养基中呈棉花状,而出发菌株呈小颗粒状,菌株cre2-3发酵液的颜色比出发菌株的更黄亮。推测cre1基因与瑞氏木霉菌株的生长代谢有关。     

番茄内生链霉菌S5的分离及其除草活性

采用植物内生放线菌分离方法从健康番茄（Lycopersicon esculentum）根中分离纯化出58株内生放线菌，从中挑选部分代表性菌株进行代谢产物除草活性检测，发现编号为S5的菌株的代谢产物对小麦（Triticum aesfivum L．）和绿豆（Phaseolus radiatus L．）种子的发芽有强烈的抑制作用，但对发芽后的幼苗生长无明显影响。以百喜草（Paspalum notatum）和狗牙根（Cynodon dactylon）为实验对象，证明S5菌株的代谢产物的确能抑制草籽的发芽，该活性具有潜在的除草效能。经初步鉴定，S5菌株为淡紫灰链霉菌淡青变种（Streptomyces lavendulaevar．glaucescens）。发酵条件实验结果表明，S5菌株在1％葡萄糖和0．3％牛肉膏的S培养基中，以2％接种量在pH7．0和25℃摇床培养，可得到最强的抑制种子发芽的生物活性。     

耐热链霉菌的分子育种改造

BIB0830是一株可将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素（AIV）的耐热链霉菌工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308（耐热链霉菌的nsdA基因中断载体,本实验室保存）导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明：与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,BIB304无明显影响。     

bkdFGH和aveD基因缺失多拉菌素工程菌株的构建

多拉菌素(doramectin)是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物,为阿维菌素的衍生物,可由基因重组阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生,在畜牧业生产中应用广泛.为获得可用于生产的能够稳定制造多拉菌素的阿维链霉菌工业菌株,本研究以阿维菌素高产菌株SAV939为基础,通过对阿维菌素生物合成基因簇进行遗传改造,构建获得阿维链霉菌突变株S.avermitilis LZ-01和LZ-02.LZ-01是通过同源双交换法构建的支链α-酮酸脱氢酶基因簇(branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase gene cluster,bkdFGH)缺失突变株,自身无法合成多拉菌素,当在发酵过程中添加环己甲酸时即可产生多拉菌素(CHC-B1).LZ-01缺失avermectin D(aveD)基因即获得突变株LZ-02,对其发酵仍可获得多拉菌素,但不再产生无效的CHC-A组分,为分离纯化提供了便利.突变菌株LZ-01和LZ-02的构建为进一步优化发酵条件,提高多拉菌素产率奠定了基础.     

航天搭载淡紫拟青霉的生物学效应

为探讨航天诱变对淡紫拟青霉的生物学效应的影响,利用淡紫拟青霉山东菌株搭载"神舟八号"宇宙飞船进行诱变处理。对筛选得到的30个淡紫拟青霉航天诱变菌株进行了形态、色素、菌丝及孢子形态、菌落生长速度、菌丝干重和产孢量等生物学检测,并测定了各诱变菌株对南方根结线虫卵和松材线虫卵的寄生率。结果表明,淡紫拟青霉航天诱变菌株各项生物学特性与原始菌株存在分化。航天诱变后的菌株菌落形态、色素和菌丝结构与原始菌株差异明显;菌落生长速度、菌丝干重和产孢量的负突变率均高于正突变率;菌株对松材线虫卵的致病力较低,寄生率最高的菌株Sd-m-20的寄生率仅为18.0%,菌株对根结线虫卵致病力较高,菌株Sd-m-9,Sd-m-11,Sd-m-16,Sd-m-22和Sd-m-26对根结线虫卵的寄生率分别提高了14.48%、14.90%、12.35%、7.66%和17.45%,显著高于原始菌株的寄生率(78.3%)。航天处理对淡紫拟青霉诱变效果显著,其优良突变菌株可能用于淡紫拟青霉对南方根结线虫的生物防治。     

空间诱变选育万隆霉素高产菌株

为获得万隆霉素高产菌株,以菌株C2507为出发菌株连续2次进行空间诱变,正突变率分别为21.33%和16.5%,筛选得到高产突变株W3-356,万隆霉素产量提高1.83倍,连续传代试验表明其产素能力具有遗传稳定性。突变株W3-356的生长速度加快,在6种营养培养基上,其形态特征有一定改变,在摇瓶发酵过程中,突变株W3-356对碳源和氮源的利用率高于出发菌株,发酵周期缩短了12h。     

西安市北郊污灌区土壤中抗铅链霉菌的多样性分析

从西安市北郊污灌区采集土样,用添加K2Cr2O7 75 μg·mL^-1和青霉素2 μg·mL^-1的高氏1号、HV和SC固体培养基分离到120株具有链霉菌特征的放线菌。采用浓度梯度法,用含Pb^2＋培养基对分离菌株进行筛选,得到50株抗铅链霉菌。在抗铅能力实验结果的基础上,选取14株抗性较强链霉菌代表菌株进行形态培养特征、生理生化和16S rDNA基因序列相似性等分析。结果表明,14株代表菌株可归为6个不同的颜色类群,其表型特征与生理生化性质和链霉菌相符合,在系统发育树上处于8个不同的进化分支。菌株HQ0031与已知链霉菌相似性差异较大,可能为链霉菌属内1个潜在新种。研究表明西安市北郊污灌区土壤中抗铅链霉菌具有丰富的多样性,可为重金属污染环境的生物修复提供有益的微生物资源。     

不利用香菇多糖的香菇单核菌株的选育

以香菇939菌株的担孢子为材料,应用紫外线诱变得到1株不能利用香菇多糖的突变株939-5,其菌落形态和生长速度与未突变H型单核菌株相同,多糖产量比未突变H型单核菌株提高30.7%,比双核菌株提高19.6%。该菌株产香菇多糖的最适碳源是淀粉,氮源为酵母膏,培养基初始pH值为6.0;Mg2+ 对其产香菇多糖有显著的促进作用;高溶氧水平则对产香菇多糖有明显的抑制作用。这些产香菇多糖的特性与已报道的香菇939菌株的S1型单核菌株相同。     

厚垣普可尼亚菌航天诱变的生物学效应

为探讨厚垣普可尼亚菌航天诱变的生物学效应,对筛选得到的29个厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株进行形态、色素、孢子形态、菌落生长速度、菌丝干重、产孢量和致病力等生物学特性检测,并测定各航天诱变菌株的耐盐性以及对苯菌灵的抗性。结果表明,厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株各项生物学特性与原始菌株存在差异。航天诱变后的菌株菌落形态和色素与原始菌株差异明显;菌落生长速度和菌丝干重的负突变率均高于正突变率;产孢量的正突变率高于负突变率;菌株Pc-m-4、Pc-m-6、Pc-m-10、Pcm-15和Pc-m-123对南方根结线虫卵的寄生率分别为92.33%、93.67%、91.67%、90.67%和90.33%,显著高于原始菌株的寄生率(81.00%),其中,菌株Pc-m-6具有较好的苯菌灵抗性,菌株Pc-m-10对盐具有较好的耐受性。航天诱变处理对厚垣普可尼亚菌影响显著,其诱变后的优良菌株具有防治南方根结线虫的潜力。     

同步辐射软X射线Nk对产L-乳酸米根霉的诱变效应

采用同步辐射软X射线Nk对米根霉AS 3.3461菌株进行辐射诱变,研究其对米根霉致死、菌落形态、种子培养以及发酵培养等特性方面的影响。结果表明,致死率曲线呈现为典型的马鞍型曲线,辐射剂量为0.72 kGy时菌株致死率最低;软X射线Nk辐照对米根霉菌落形态有一定影响;种子培养特性和发酵培养特性的诱变前后对比表明,种子延滞期缩短了3h,突变株N-15的L-乳酸产量提高了25.6%,LDH活性提高了95.8%,ADH的活性降低了77.7%。     

利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株

PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体，并成功地置换了阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）bkdF基因。先合成1对长度分别为58和59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒（aac（3）Ⅳ＋onT）两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌（Eschcrichia．coli）菌株BW25113／pU790／pXW1224，获得了阳性重组质粒pXW1230。将该质粒中的大小为4．0kbBglⅡ目的片段插入基因置换载体pHZl35l，再接合转移至阿维链霉菌BJBM9903，筛选得到表型为Apma^RThio^S的接合子。PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析，证实该接合子为敞dkdF^-突变株。     

对根结线虫高毒力芽胞杆菌的鉴定及其活性测定

为筛选高效安全的杀虫资源,从海底淤泥中分离到一株对根结线虫(Meloidogyne spp.)高毒力的芽胞杆菌YBf-10,PCR扩增16S rRAN基因,经测序、序列比对分析和系统进化树构建,发现其与坚强芽胞杆菌(Bacillus firmus)Z1-7菌株16S rDNA同源性为99%,初步确定所分离的菌株为坚强芽胞杆菌。将该菌株培养至芽胞成熟,离心取上清,10倍稀释后进行生物测定,发现其对北方根结线虫二龄幼虫有很高的毒力。处理24h校正死亡率达到50%以上,72h达到100%。对根结线虫虫卵进行毒力测定表明,作用48h后能显著抑制虫卵孵化达到80%以上。在培养过程中分不同时段取样,并用所取样品上清进行生物测定,发现从稳定期开始表现出了对北方根结线虫的毒力,在整个稳定期毒力持续增强,直到衰亡期后期,毒力达到最高,表明坚强芽胞杆菌所产生的杀线虫活性物质主要是在稳定期合成的。将发酵上清80℃处理30min毒力无明显变化,通过饱和硫酸铵沉淀上清中蛋白,该蛋白对线虫无明显毒力,但是去蛋白后的上清对线虫仍然具有与未经处理上清相似的杀线虫活性,表明坚强芽胞杆菌产生的杀线虫活性物质是一种非蛋白类的小分子化合物。研究结果提示,本研究所分离的坚强芽胞杆菌在稳定期能够大量合成对线虫具有毒杀活性的小分子化合物,对根结线虫表现出极高毒力,为利用该菌株开发植物寄生线虫生防制剂提供了杀虫资源。     

同步辐射软X射线Nk对产L-乳酸米根霉的诱变效应

采用同步辐射软X射线Nk对米根霉AS 3.3461菌株进行辐射诱变,研究其对米根霉致死、菌落形态、种子培养以及发酵培养等特性方面的影响。结果表明,致死率曲线呈现为典型的马鞍型曲线,辐射剂量为0.72 kGy时菌株致死率最低;软X射线Nk辐照对米根霉菌落形态有一定影响;种子培养特性和发酵培养特性的诱变前后对比表明,种子延滞期缩短了3h,突变株N-15的L-乳酸产量提高了25.6%,LDH活性提高了95.8%,ADH的活性降低了77.7%。     

阿维拉霉素高产突变株H15形态分化初步研究

采用电镜及荧光显微镜方法,对经60Coγ诱变筛选获得的绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)阿维拉霉素高产突变株H15的菌落、孢子丝、分生孢子分化特征进行了研究。与原始菌株4.1119不同的是,突变株H15形态呈现显著变异:灰白绿色菌落,直线型孢子丝,分生孢子表面光滑无刺突,而菌株4.1119为螺旋状孢子丝,孢子表面带刺。液体培养菌丝荧光染色结果表明,H15菌株在液体培养条件下菌丝团形态分化过程也发生显著改变,孢子萌发形成多隔室菌丝,放射状生长逐渐形成菌丝团,核心菌丝出现凋亡后,菌丝团直径增长停滞。与原始菌株相比,突变株H15菌丝的成簇、形成完整菌丝团需要较长时间(48h才形成完整菌丝团,245μm),菌丝团直径增长停滞阶段及凋亡的延滞使得产物阿维拉霉素得以较好积累,阿维拉霉素的合成主要集中在此阶段。此后菌丝生物量虽维持小幅波动,但对阿维拉霉素的积累没有意义。因此推测菌丝团的形成历程、停滞阶段菌丝团直径增长及凋亡"相对平衡"对于阿维拉霉素的积累可能有重要意义。     

提高耐热链霉菌转化泰乐菌素能力的分子改造与育种

BIB0830是将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)的耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌(Escherichia coli)-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308(耐热链霉菌的nsdA基因中断载体)导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。经PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,而BIB304则无明显影响。