甘蓝类植物小孢子培养及植株再生研究

对3个甘蓝类植物(甘蓝、青花菜、羽衣甘蓝)19个品种小孢子胚胎发生和植株再生的影响因素进行了研究,结果表明,基因型不仅影响供试材料的小孢子胚状体发生频率,也影响胚状体的质量;4℃低温预处理0 ～2d结合32.5℃热激1d,能显著提高供试基因型小孢子出胚率.胚状体先在NLN-13液体培养基中培养25d,有利于胚状体分化成苗;后在B5固体分化培养基中添加1％ ～1.2％琼脂,可有效促进胚状体萌发和植株再生.小孢子再生植株先使用流式细胞仪在生长初期鉴定倍性,后对单倍体植株采用200mg·L-1秋水仙碱浸根处理20h,并用流式细胞仪鉴定,此方法可快速、有效地获得双单倍体植株.     

不结球白菜游离小孢子培养及植株再生研究

为进一步优化不结球白菜游离小孢子培养技术体系,本研究以20个不同基因型的不结球白菜为试验材料,研究不同基因型、4℃低温胁迫处理时间和头孢噻胯浓度对游离小孢子胚胎发生的影响,并对小孢子胚胎发育和再生过程进行观察和倍性鉴定。结果表明,当花瓣/花药(P/A)长度比值为0.85～1.10时,不结球白菜小孢子主要处于单核晚期;共有10个基因型不结球白菜出胚,其中出胚率最大的为H20,平均出胚率为7.75胚·10蕾^-1;4℃低温胁迫处理1 d时不结球白菜出胚率最高;头孢噻胯对不结球白菜出胚率的影响与基因型密切相关;从胚状体到再生幼苗阶段,不结球白菜基因型不同,其胚胎再生频率也不同;倍性鉴定共检测出21个双单倍体和2个单倍体,自然加倍率为91.3%,不结球白菜植株形态表现出明显的多样性。本研究结果为不结球白菜游离小孢子高效培养体系的优化提供了一定的技术支撑。     

低温预处理和高温饥饿胁迫对冬小麦小孢子胚胎发生和植株再生的影响

以几种不同基因型的冬小麦(Triticum aestivum)为材料，研究了低温预处理(单核早期的离体麦穗，4℃，处理3周)和高温饥饿胁迫(上述处理过的麦穗的花药，置于饥饿培养基B中，33℃处理4d)对几种冬小麦基因型小孢子胚胎发生和植株再生的影响。结果表明：高温饥饿处理后，供试6种基因型都得到了诱导胚，其中F1-2获得的胚最多，为107．2／穗；低温预处理后，供试6种基因型中有5个基因型获得了诱导胚，说明高温饥饿处理可以在一定程度上克服基因型对胚胎发生的限制作用；高温饥饿预处理后，可获得大量的小孢子胚胎，但胚胎发育缓慢，分化绿苗频率极低：低温处理诱导产生的胚胎虽然相对较少，但胚胎生长速度快，再生能力强，绿苗产量高，适合在加倍单倍体育种中应用。     

基于高通量测序的青花菜早期发育小孢子转录组分析与基因功能注释

为探明青花菜小孢子胚胎发育的分子生物学机制,本研究利用Illumina Hi Seq TM 2000平台对在32.5℃环境下分别培养17 h和24 h以及25℃环境下分别培养0、1和6 d的小孢子进行转录组分析及基因功能注释。结果表明,共获得174 324条Unigenes,其中有144 194条注释到GO、COG、KEGG、NR、Swissprot和Pfam数据库。GO注释显示,小孢子差异表达基因在细胞部分、细胞和细胞器、结合和催化活性、代谢过程、细胞过程和单一生物过程功能亚类中所占比较最高;功能分类中一般功能预测(R)、复制、重组与修复(L)、转录(K)、信号转导机制(T)和翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣(O)在COG同源分类所占比例最高;KEGG注释结果表明,热击后小孢子差异基因最显著富集通路为内质网蛋白加工代谢途径、植物病原互作及植物激素信号转导剪接体途径。本试验结果为进一步深入研究青花菜小孢子胚胎发生的生理生化和分子机制奠定了理论基础。     

菜苔小孢子培养及再生植株的倍性鉴定*

以早熟菜苔(Brassica rapa ssp．parachinensis)品种油青四九为供体材料，研究了更新培养液和秋水仙碱分别直接处理分离的菜苔小孢子对胚发生频率的影响。分离小孢子先用NLN-17培养液32℃热激培养2d，换成NLN-10培养液后在24℃继续培养，比不换培养液直接用NLN-10培养液处理的胚状体产量明显提高，更新培养液并能改善胚状体质量。用秋水仙碱0．8mg／L直接处理分离小孢子能明显增加胚状体产量，秋水仙碱浓度过高不利出胚和胚状体萌发。流式细胞仪(FCM)鉴定菜苔小孢子再生植株的染色体倍性表明，有较高的自发二倍体率(70％)和四倍体率(8％)，而其它多倍体和混倍体比率相对较少。     

红花小孢子培养与胚状体诱导研究

小孢子培养是创造单倍体和双单倍体的重要途径,对提高红花的育种效率具有重要意义。为了研究红花游离小孢子的高效培养体系,用20份红花材料研究花药及小孢子培养中影响愈伤组织生长和胚发生的关键因素。结果表明,小孢子发育时期、红花品种、基本培养基和激素浓度是影响红花诱导愈伤组织的关键因素。花药培养的愈伤及胚诱导率高于游离小孢子,且受基因型影响。单核靠边期管状花长度为 0.45～0.50 cm时,诱导成功率达到68.32%。供试的20份红花材料中,有11份诱导出了愈伤组织,有1份分化出了胚状愈伤,诱导成功率为15.79%。分化培养最适培养基组合为1/2 MS+B5+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L;小孢子悬浮培养最适培养基激素浓度以添加6-BA 4.0 mg/L 和NAA 0.5 mg/L效果最好,诱导愈伤率为22.5%。     

结球甘蓝小孢子胚诱导与植株再生

以4个结球甘蓝品种为试材,研究不同条件对小孢子胚诱导和植株再生的影响.结果表明:基因型是限制小孢子胚发生的主要因素.适宜取材的花蕾大小为2.5～4.0mm,瓣药比为2/3 ～7/6,盛花期是取蕾的适宜时期;培养基大量元素减半和添加适量活性炭均可显著提高胚状体诱导率,但对于难出胚基因型没有起到诱导出胚的作用;胚状体的诱导和萌芽需要植物生长调节剂NAA和6-BA的参与,适宜的胚状体诱导培养基为NLN-13+0.2mg· L-1 6-BA+0.1mg·L-1 NAA,胚状体诱导率为38胚/10蕾,适宜的胚状体生芽培养基为MS+0.4mg·L-16-BA +0.1mg·L-1 NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂,芽诱导率达46.7％.     

抗生素在甘蓝类蔬菜小孢子胚胎发生中的双重作用

为克服甘蓝类蔬菜游离小孢子培养中的细菌污染,以1个青花菜纯合系和2个结球甘蓝纯合系为试验材料,研究培养基中分别添加2种抗生素——头孢噻胯和羧苄青霉素对小孢子培养中细菌污染、胚胎发生和胚植株再生的影响。结果表明,2种抗生素的添加(25、50、100、200 mg·L~(-1))能够显著降低小孢子培养中的细菌污染;50 mg·L~(-1)头孢噻胯和羧苄青霉素的添加显著促进了结球甘蓝、青花菜胚胎发生和植株再生频率;抗生素处理高于50 mg·L~(-1)时,小孢子死亡率升高,同时小孢子的发育受到抑制。本研究报道了抗生素在小孢子培养中的双重作用,尤其是对于胚胎发生的促进作用,这对加快单倍体育种进程具有重要意义。     

茄子游离小孢子培养中小孢子发育的细胞学观察

本文以茄子（Solanum melongena L.）杂交F1代的植株为试验材料，通过游离小孢子的培养，对小孢子脱分化、再分化形成再生植株的发育途径，进行了较为详细的形态细胞学观察。其结果如下：（1）小孢子进行均等分裂和营养细胞分裂两种方式都能形成胚状体或愈伤组织。生殖细胞仅分裂1-2次。（2）多细胞小孢子从花粉沟或萌发孔突出来脱掉花粉壁。（3）花药组织在胚状体形成过程中起着重要作用。（4）从获得的再生植株中，随机取37株进行根尖细胞染色体观察发现，22株为单倍体，14株为二倍体，1株为四倍体。     

离体诱变对大麦游离小孢子培养影响的初步研究

本文研究了离体诱变对大麦游离小孢子培养的影响。结果表明，大麦花药预培养３６后，经５００ｒａｄγ射线辐照，加快了小孢子的出愈速度，对小孢子分裂启动的比率影响不大，对胚状和愈伤组织的形成则有不利影响，其出愈率为２５．３％，比对照３７．１％低，但该处理产生的胚状体有一定的绿苗分化能力。在挑取花药前，穗子经５００ｒａｄγ射线辐照，不仅延缓了出愈时间，而且严重降低了孢子分裂启动的比率，从而使胚状体和愈伤组织的形成数大幅度下降，出愈率从对照３７．１％下降到２．８％。     

羽衣甘蓝双单倍体育种技术研究

羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)属十字花科(Cruciferea)芸薹属(Brassica)植物,其园艺品种具有叶色鲜艳,耐寒性强的特点,是一种特别适合于晚秋至早春使用的赏食兼用型植物材质。其杂种优势强,商品种基本为F1杂种。在多年观赏羽衣甘蓝双单倍体育种实践的基础上,本研究对包含商品种及其F2至F3代,以及新配制杂交组合在内的103份试材基因型的双单倍体(double haploid,DH)纯系培育及其育种应用进行总结报道。采用游离小孢子培养,在皱叶、圆叶、羽叶、插花四大类型材料中均获得了DH植株,具胚状体形成的基因型频率为77.7%,55.3%的试材获得了小孢子再生植株;不同基因型平均每皿(3×105小孢子)的出胚数在0~314个之间,DH系间的杂种具有更高的出胚能力。整体上羽衣甘蓝胚状体发育同步性不高,胚状体的植株再生率在0~51.3%之间。F1比其自交后代具有更好的胚状体发生能力,在F2~F3代中,仍然存在具有较好胚状体诱导能力的单株。小孢子植株的倍性复杂,包含单倍、二倍、三倍、四倍及混倍体,二倍体率平均为42.7%。F1材料的小孢子再生株表型多样性丰富,叶色、叶型、株型等性状在DH系中得到了快速固定和多层次表现,隐性基因性状得到表达;F3代材料的小孢子再生株表型性状趋同性高,变异幅度低。与常规育种相比,采用DH技术,可以在羽衣甘蓝F1新品种培育上缩短一半以上的时间。本研究结果不仅为羽衣甘蓝,而且也为其他作物的DH育种提供了较完整的借鉴。     

甘蓝型油菜正季与反季材料小孢子的培养

本文以甘蓝型油菜Westar的F1代为供试材料,通过对8个正季和同样的8个反季材料进行小孢子培养对比实验。结果表明,相同材料（基因型）正季能获得胚状体的反季一样能获得胚状体,但是相同材料的出胚数反季要比正季少50%,并且出胚时间要晚5～8d。正季与反季材料的成苗百分率相同,平均达到93%,加倍率基本一样,达到80%。由此可见,用反季节材料培养小孢子同样能获得成功,对特殊材料可以利用此法进一步加速育种进程。     

小孢子培养有效获得松花型花椰菜DH再生植株

对5个松花型花椰菜杂种一代的小孢子培养研究表明，小孢子胎胚发生主要依赖于基因型，庆农65天的每花蕾胚状体产量最高，平均达15.5个。松花菜的胚状体萌发率一般在30%左右，并有效获得了大量的DH再生植株。冷击预处理能显著影响花椰菜小孢子的胚胎发生，但供体材料间存在不同的结果。结球期和开花结角期再生植株的生育期与育性出现较大分离，可育且能正常结角的比例约占全部小孢子再生植株的50%以上，因而不再需要加倍处理。     

小孢子培养获得松花型花椰菜DH再生植株

对5个松花型花椰菜(Brassica oleraceavar.botrytisL.)杂种一代的小孢子培养研究表明,小孢子胎胚发生主要依赖于基因型,庆农65天的每花蕾胚状体产量最高,平均达15.5个。松花菜的胚状体萌发率一般在30%左右,并有效地获得了大量的DH再生植株。冷激预处理能显著地影响花椰菜小孢子的胚胎发生,但供体材料间存在不同的结果。结球期和开花结角期再生植株的生育期与育性出现较大分离,可育且能正常结角的比例约占全部小孢子再生植株的50%以上,因而不再需要加倍处理。     

玉米小孢子胚胎发生的细胞形态学观察

通过观察玉米小孢子胚胎发生的细胞形态学特征,发现：离体培养条件下单核后期的花粉可以通过均等分裂和不均等分裂两条途径形成胚状体,与前人的研究结果一致。淀粉的积累,多核小孢子的液泡化以及花药壁的衰退都可影响雄核发育。将诱导培养3周的花药转移到降低蔗糖浓度、去除TZBA并附加KT的分化培养基上,有利于球形胚和梨形胚的极性分化和成熟,而发育较迟的胚状体则停止发育,趋向退化。因此胚状体之间出现明显的两极分化。     

番茄游离小孢子培养形成胚状体的初步研究

对４个番茄栽培及一个野生种进行了直接游离小孢培养的初步研究,所有供试材料均得到了胚状体,早粉二号同时获得胚状及愈伤,美味樱桃番茄得到了球形胚。类心型胚等胚状体。对一些诱导因素进行了初步探索,发现供体植株的基因型及生长环境对培养结果有影响,其中供体植株所处的生长环间的影响较为重要。     

培养基水分状况对大白菜小孢子胚成苗的影响

为提高大白菜小孢子胚成苗率，对影响胚发育成苗的培养基水分状况进行了研究。在诱导胚 生的ＮＬＮ１３培养基中、培养－３周形成的子叶期胚质量好，成苗率高，随着培养时间的延长，胚质量和成苗率逐渐降低。诱导胚发育成苗的ＭＳ０培养基的琼脂含量，对于小孢子胚的成苗率有重要的影响。     

刺槐同源四倍体种子胚变异及生活力分析

为了阐明刺槐同源四倍体种子胚变异状况及充分利用刺槐同源四倍体有性过程创造的变异资源对四倍体刺槐进行遗传改良,研究了刺槐同源四倍体种子胚类型及其生活力特征,主要结论如下：刺槐同源四倍体种子胚按照子叶数量、颜色及饱满程度,可以划分出5个类型： 黄二(YVT)、黄三(YMT)、黄四(YRF) 、绿二(GNT)及白二(WNT),所有类型种子胚混合平均单胚重量接近二倍体的1/2。流式细胞仪检测证明,YVT、YMT、 YRF类型样本种子胚染色体数目仍然是四倍体。刺槐同源四倍体种子胚可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性明显低于二倍体相应指标,YVT、YMT、 YRF类型种子胚的上述2种指标明显高于GNT、WNT类型。以刺槐同源四倍体种子胚愈伤组织诱导率作为种子胚生活力强弱的评定指标表明：上述2种指标越高的种子胚,其生活力就越高,上述2种指标均小于二倍体相应指标的30% 是刺槐同源四倍体种子胚生活力丧失的临界指标;YVT、YMT、 YRF类型种子胚上述2种指标均高于二倍体相应指标的30%,组织培养时均有一定的愈伤组织诱导率,具一定的生活力,其中YVT类种子胚的愈伤组织诱导率最高（平均57.8%）、生活力最强,已培育出此3类胚的实生苗; GNT、WNT类型种子胚上述2种指标均低于二倍体相应指标的30%,组织培养时愈伤组织诱导率为0,胚细胞均失去了生命力。较好的种子胚愈伤组织诱导培养基综合条件为： MS基本培养基附加2,4-D 2.0 mg/L和6-BA 0.5 mg/L。     

青花菜绿雄60小孢子单核靠边期与花蕾外部形态特征研究

以青花菜F1代杂交种绿雄60为材料,研究了青花菜小孢子单核靠边期花蕾的特征。结果表明,通过整枝可以得到发育整齐的青花菜小孢子花蕾,当花蕾长度为3.70～4.70 mm时,单核靠边期小孢子比例最高,此时花蕾为绿色,花药黄绿色,花瓣/花药为0.83～1.00。以上指标可以作为青花菜小孢子取样的参考指标。     

钙调蛋白(CaM)对附植前小鼠胚胎热休克蛋白70(HSP70)表达的影响

体外培养的奶牛,绵羊和小鼠的附植前胚胎在热应激条件下能够合成热休克蛋白70以增强胚胎的耐热性保护其不受热损伤.而钙调蛋白(CaM)是细胞内最重要的Ca2+受体蛋白并参与细胞活动中重要基因的转录活动.本实验旨在研究CaM参与小鼠(Mus musculus)胚胎热应激诱导型热休克蛋白70(HSP70)的表达,且明确CaM参与HSP70表达的具体途径.将发育至早期囊胚的胚胎分成空白对照(37℃)组、W7处理非热应激(37℃+W7)组、热应激(39℃)组和W7处理热应激(39℃+W7)组.提取总RNA并分别检测HSP70、CaM和热休克转录因子1(HSFl) mRNA表达;提取胞浆蛋白用Western blot技术检测HSP70、CaM和HSF1表达;用免疫共沉淀法检测HSP70-CaM和HSP70-HSF1复合物.结果发现,W7能显著抑制39℃热应激1h小鼠胚胎HSP70 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05); W7对其他各组胚胎HSF1mRNA表达的影响不显著(P＞0.05),但能显著降低39℃热应激1h小鼠胚胎HSF1蛋白表达(P＜0.05); 39℃热应激时,胚胎HSP70-CaM复合物增多,HSP70-HSF1复合物减少.本研究表明,小鼠胚胎受热应激时,CaM通过与HSP70竞争性结合,解离出HSF1,从而使HSP70大量表达.本研究揭示了CaM参与小鼠胚胎热激反应中HSP70表达的一种途径.可为研究胚胎耐热性以及热激信号转导提供基础资料.