培养液及血清浓度对山羊孤雌胚胎体外培养的影响

试验比较了在SOFaa，CRlaa，mCRlaa3种培养液中添加不同浓度的成年山羊血清(NGS)对山羊孤雌胚胎进行体外培养的效果。结果表明：在3种培养液中，添加10％的NGS对山羊孤雌胚胎的体外发育效果较好，囊胚率分别可达62．79％(81／129)、53．52%(38／71)、13．64％(12／88)；mCRlaa组囊胚发育率和囊胚细胞数显著低于SOFaa组和CRlaa组，SOFaa组优于CRlaa组．但SOFaa组和CRlaa组间无显著差异。在现有试验条件下，以在SOFaa培养液中．山羊孤雌胚胎的体外培养的第72小时时加入10％的NGS的发育效果较好，囊胚率可达62．79％。     

FBS和不同培养液对牛孤雌胚体外发育的影响

研究培养液中血清的添加时间和添加浓度及不同培养体系对牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响。结果表明：牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天添加10％的FBS对孤雌胚的体外发育效果；良好。4种培养体系在孤雌激活后的第3天添加10％的FBS，平均囊胚率分别可达46．25％（SOFaar）、43．58％（CRlaa）、40．25％（KSOMaa）、17．98％（TCM199）；TCM199组的囊胚率显著低于其他3组（P〈0.05），SOFaa优于CRlaa和KSOMaa组，但差异不显著（P〉0．05）。     

FBS和不同养液对牛孤雌胚体外发育的影响

研究培养液中血清的添加时间和添加浓度及不同培养体系对牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响.结果表明:牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天添加10%的FBS对孤雌胚的体外发育效果良好.4 种培养体系在孤雌激活后的第3天添加10%的FBS,平均囊胚率分别可达46.25%(SOFaa)、43.58%(CRlaa)、40.25%(KSOMaa)、17.98%(TCM199);TCM199组的囊胚率显著低于其他3组(P＜0.05),SOFaa优于CRlaa和KSOMaa组,但差异不显著(P＞O.05).     

黄淮白山羊孤雌胚胎的体外培养

采用离子霉素和6-DMAP对黄淮白山羊体外成熟卵母细胞进行联合激活,分别在不同的培养体系进行体外培养,观察孤雌胚胎的发育情况。培养体系分别为:无共培养条件下,M199(10?S)、CR1aa和HTF P1;颗粒细胞共培养条件下,CR1aa、HTF P1和SOFaa。结果发现,无共培养条件下,CR1aa和HTF P1组孤雌胚胎的卵裂率显著高于M199组(P<0.05),但3组均未有囊胚;共培养条件下,HTF P1组的卵裂率显著高于CR1aa和SOFaa组(P<0.05),而CR1aa组的囊胚率却显著高于其他2组(P<0.05)。综合试验结果说明,CR1aa联合颗粒细胞共培养能够获得较好的培养效果,适用于山羊孤雌胚胎的体外培养。     

牛孤雌生殖胚与体外受精胚体外发育比较

从卵巢采集的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)经体外成熟培养24 h后,随机分为2组分别用于孤雌激活与体外受精.在相同培养条件下,比较孤雌生殖胚与体外受精胚的发育率和发育速度.结果表明将牛孤雌生殖胚与体外受精胚分别置于mSOFaa和mBECMaa培养液中培养,卵裂率(89.3%vs.80.1%;83.2%vs.82.5%)、囊胚发育率(27.5%vs.24.0%;28.9%vs.21.9%)和孵化率(58.7%vs.56.7%;51.5%vs.53.3%),均无显著差异(P＞0.05);孤雌生殖胚与体外受精胚在体外发育的速度基本相同.对孤雌生殖胚胎进行培养可以代替体外受精胚胎筛选最佳体外培养系统.     

维生素E提高牛孤雌胚胎的体外发育研究

体外生产的牛孤雌胚胎用添加了VE，VE＋VC的CR1aa培养液，置38．5℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中进行培养。通过荧光染料Hoechst 33342对胚泡进行荧光染色，检测孵化囊胚的总细胞数。结果表明，当培养基中添加100μmol／LVE时，与对照组相比，扩张囊胚发育率和胚泡的细胞总数显著提高（P〈0．01）；当VE与VC联用时，发育到早期囊胚、扩张囊胚、孵化囊胚的数量和胚泡的总细胞数均低于单独使用VE的培养组。     

猪胚胎体外培养影响因素的研究

以孤雌激活胚胎为研究对象,对猪胚胎体外培养过程中的相关影响因素进行了探讨。体外成熟的猪卵母细胞经孤雌激活后,用添加0.5%牛血清蛋白(BSA)的NCSU-23(北卡罗来纳州立大学-23)培养基培养的囊胚率(36.7%)极显著高于添加5%、10%和15%胎牛血清(FCS)的NCSU-23(11.8%,18.5%和10.3%,P0.01)。在NCSU-23中添加一定比例的TCM-199(10%,25%和50%),虽然对猪卵母细胞孤雌激活后的分裂率无显著影响(89.6%vs87.0%,83.4%和82.6%,P0.05),但囊胚发育率随着TCM-199比例的增加而显著下降(30.1%vs25.0%,11.1%和1.1%,P0.05)。结果表明:培养液中添加BSA的猪胚胎体外培养效果优于添加FCS;猪胚胎的体外培养不需要成分复杂的培养液。     

不同石蜡油对水牛孤雌激活胚胎体外发育的影响

水牛孤雌激活胚胎体外培养时采用石蜡油覆盖微滴培养,本文就几种不同石蜡油(协和油、Ameresco油、Sigma胚胎培养油和Sigma过滤油)对水牛孤雌激活胚胎体外发育的影响进行了研究。结果显示:在分裂率、孵化率上,不同石蜡油之间无明显差异;在7d囊胚率和总囊胚率上,分别为协和油32.1%、39.4%,Sigma胚胎培养油39.9%、42.8%,Sigma过滤油34.4%、40.2%,几组之间差异不显著;而Ameresco油7d囊胚率和总囊胚率分别为22.9%、28.8%,与Sigma胚胎培养油、Sigma过滤油之间差异显著(P<0.05)。     

不同成熟时间的猪卵母细胞对体外受精的影响及孤雌发育

采用NCSU-37为体外成熟、受精、培养体系,比较不同成熟时间46h、58h和70h的猪卵母细胞对体外受精的影响和孤雌发育。结果显示,猪卵母细胞在体外成熟培养46h、58h和70h后,46h培养组的卵母细胞体外受精后的卵裂率明显低于58h和70h培养组(P<0.05),但囊胚发育率明显高于其他两组(P<0.05)。46h组的孤雌发育率明显高于其他两组(P<0.05),囊胚发育率三组之间无显著差异。表明猪卵母细胞体外成熟培养时间延长,体外受精后的囊胚发育率降低,孤雌发育率相应增加。     

不同培养体系对牛胚胎体外发育的影响

采用离子霉素和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)对牛体外成熟卵母细胞进行联合激活,激活后采用不同的培养体系进行体外培养,观察不同的培养液对牛孤雌激活胚体外发育能力的影响。3种培养体系分别为:A(0~48 h:CR1aa+3 mg/mL BSA;48 h~7 d:CR1aa+10%FBS),B(连续7 d均为SOFaa+3 mg/mL BSA),C(0~5 d:SOFaa+3 mg/mL BSA;6~7 d:SOFaa+10%FBS)。结果表明:3种培养液对卵裂率没有显著性影响,分别为87.22%,94.33%和91.30%,但囊胚发育率存在显著性差异,以A效果最好,其囊胚发育率为25.56%;C次之,囊胚发育率为11.80%;B最低,囊胚发育率为3.55%。之后选择最佳的培养液进行体外受精实验,结果表明CR1aa可用做牛胚胎体外生产的培养液。     

CR1aa-卵丘细胞共培养牛体外受精卵的卵裂率及囊胚率

牛卵母细胞用5％CS的TCM－199培养液体外成熟培养（IVM）22h；以BO液＋咖啡因作精子获能处理1.5h；BO液＋BSA的培养液体外受精（IVF）5h；受精卵（含卵丘细胞）用5％CS的CR1aa培养液在5％CO2、955空气、38.5℃、饱和湿度的培养环境中体外培养（IVC）7－8d，结果受精卵裂率为72.4%（56.3%－81.0%），囊胚率23.7%(12.5%-40.9%）。     

牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究

探讨了人工合成培养液ＣＲ１ａａ和小鼠胎仔成纤维细胞对牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明，牛体外受精卵在ＣＲ１ａａ液中的卵裂率达７６．２％，８细胞胚的比率达４４．８％。小鼠胎仔成纤维细胞能够显著促进牛体外受精的早期囊胚以上胚胎的发育。牛体外受精后第５、６天的早期胚胎分别与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，在受精后第７天发育至囊胚以上的比率分别达１９．８％和２４．６％；受精后第８天，孵化的囊胚比例分别达５．２％和７．５％。实验表明，受精后第５、６天的牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，可显著提高扩张囊胚和孵化囊胚数量。小鼠成纤维细胞对胚胎发育的支持作用取决于胚胎发育阶段     

大肠杆菌F1菌毛表达条件的初探

Ｆ１菌毛在体外表达受到许多因素的影响。为了对Ｆ１菌毛的进一步研究,本试验以只产Ｆ１菌毛的菌株Ｃ６００为对象,从培养基、温度、ｐＨ、通氧等条件进行了摸索,实验结果表明：培养条件的限制极为显著,在ＭＤ－１肉汤（ｐＨ６．８～７．２）中、３７℃、静止培养４８ｈ可使Ｆ１菌毛获得较好表达;通入氧气将有利于Ｆ１菌毛的表达。     

猪丁型冠状病毒在悬浮培养猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性分析

旨在分析猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)在悬浮培养的猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性,为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供细胞材料。采用逐步降血清法优化LLC-PK1细胞悬浮培养工艺;利用有限稀释法筛选PDCoV适应性细胞株;利用间接免疫荧光法鉴定PDCoV对LLC-PK1细胞的感染性;分别对PDCoV接种LLC-PK1悬浮细胞的初始密度、MOI、收毒时间、TPCK胰酶浓度等参数进行优化,确定最佳悬浮培养条件。成功筛选出可高效增殖PDCoV的单克隆悬浮细胞株LLC-PK1Sa,且利用其增殖的PDCoV可特异性的感染LLC-PK1细胞;PDCoV按MOI为10^-3接种于密度为2×10⁶ cells·mL^-1的LLC-PK1Sa细胞,当TPCK胰酶终浓度达到7.5 μg·mL^-1时,接毒后48 h收获的病毒液滴度最高。本研究首次实现了PDCoV在LLC-PK1Sa悬浮细胞中的高效增殖,并对悬浮培养条件进行了初步优化,可为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供理论参考。     

MSB-1培养物上清液对MDV的作用

研究了马立克氏病肿瘤细胞系（ＭＳＢ－１）培养物上清液对马立克氏病病毒（ＭＤＶ）体外增殖及体内致瘤作用的影响。结果表明，该上清液对体外ＭＤＶ的增殖有明显的特异性的抑制作用，并且这种抑制活性保持至少２３ｄ不降低，而对体内ＭＤＶ的致瘤作用有明显的促进作用，但其本身在鸡体内并无明显的快速致瘤作用。     

湖桑无土栽培试验研究

湖桑32号无土栽培，用ABT1号生根粉以浓度50mg/kg处理桑根，栽培基质以刨花为好，营养液中的大量元素浓度以1－2‰为宜。     

核桃组培快繁体系的建立

为建立‘南核1号’核桃组培快繁体系,以带芽茎段为外植体,开展外植体采集时间、初代诱导、继代增殖和生根培养各阶段试验。结果表明,全年中4-5月为最佳外植体采集时间;最佳诱导培养基为DKW+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L,诱导率为66.7%;最佳增殖培养基为DKW+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01mg/L,增殖率为63.3%,增殖系数为3.83;生根采用二步诱导生根法,先在附加IBA 6.0mg/L的1/2DKW中暗培养,再转移到1/4DKW中光培养,生根率为46.6%。     

Follicular fluid concentration of transforming growth factor-beta1 is negatively correlated with estradiol and follicle size at the early stage of development of the first-wave cohort of bovine ovarian follicles

The objectives of this study were to characterize the relationship between estradiol and transforming growth factor-β1(TGF-β1) concentrations in follicular fluid of growing bovine ovarian follicles, and to examine the effect of TGF-β1 on FSH-stimulated estradiol secretion in cultured bovine granulosa cells. Follicular fluid was collected from individual follicles >5 mm in diameter by ultrasound-guided transvaginal puncture (n = 12 heifers). Follicles were sampled at four different stages of development of the first post-ovulatory wave during selection of the single dominant follicle. Estradiol, progesterone and total TGF-β1 were measured in follicular fluid of the three or four largest follicles sampled when the largest follicle (F1) had reached either 6.5, 7.5, 8.5 or 9.5 ± 0.5 mm stage of development. There was a significant negative relationship between follicular fluid TGF-β1 and estradiol concentrations (R² = 0.44; p < 0.002), and between TGF-β1 concentrations and follicle diameter (R² = 0.23; p < 0.01) in cohort follicles at the 6.5 mm stage, but not at any later stage of development of the follicle wave. There was no correlation between progesterone and TGF-β1 concentrations at any stage. To assess the causal relationship between TGF-β1 and estradiol, granulosa cells from follicles measuring 2–5 mm at dissection were placed in serum-free culture. TGF-β1 caused a dose-dependent decrease in FSH-stimulated estradiol secretion (P < 0.001). These findings suggest that TGF-β1 has an inhibitory effect on estradiol secretion in FSH-stimulated follicles and that a reduction in TGF-β1 inhibition may be part of the mechanism of selection of a single dominant follicle.     

农杆菌介导的匍匐翦股颖胚性愈伤组织的转化和转CBF1基因植株的获得

以匍匐翦股颖成熟胚诱导的胚性愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法就不同的菌液浓度、共培养条件和真空处理等对愈伤组织的转化效率进行研究.结果表明,适宜的农杆菌侵染浓度光密度OD600nm为0.8～1.2,真空处理加全光照的共培养条件有助于提高转化效率;CBF1基因是来源于拟南芥的与抗逆相关的转录因子基因,在匍匐翦股颖中实现了其转化,通过PCR检测,50株转基因植株中32株扩增出640bp的目标片断,部分转基因植株生长缓慢,表现出矮化性状.非胁迫条件下,转基因植株游离脯氨酸含量为对照的5倍.断水处理5d后,转基因植株生长基本正常,脯氨酸含量增加约2倍,比对照植株高2～3倍.