化学去核卵母细胞为受体的小鼠体细胞核移植

卵母细胞的化学去核是采用干扰染色体分离或纺锤体正常功能的化学试剂,使其所有染色质通过纺锤丝牢固结合,并借助极体排出的惯性将所有染色质全部带出胞外,达到去核目的。目前以化学去核处理的MⅡ期卵母细胞为受体,已获得克隆小鼠。然而,第一次减数分裂期的小鼠卵母细胞经化学去核后,进行核移植还未见报道。与传统的机械去核相比,该方法对卵母细胞无机械损伤,完全是极体的自然排放;同时细胞质及其中核重编程相关因子损失量小;而且高效、省时,程序简单,所得的卵胞质或许更适合于供体细胞核的重编程。剪取超排小鼠的卵巢,以注射器刺破有腔卵泡后获得卵母细胞和卵丘细胞复合体,进行体外成熟培养。成熟培养5 h后去除卵丘细胞,挑选生发泡破裂的细胞顺序移入含脱羰秋水仙碱(DC,0.4μg/mL,2 h)和DC(0.4μg/L) 放线菌酮(CHX,50μg/mL)的M16培养液中继续培养,直到第一极体排出。去核卵胞质与胎儿成纤维细胞用植物凝集素(PHA,200μg/mL)粘合后,转入电击槽;施加1个5 V/mm、3μs交流电脉冲和2个92 V/mm、70μs直流电脉冲进行电融合。3 h后,以SrCl2激活6h,于四孔培养皿中制作的“孔中孔”(well of well)体外培养重构胚。试验重复3次,共计698个卵母细胞,获得的重构胚融合率和激活率分别为84.8%和93.6%;胚胎2-细胞发育率为24.7%,4-细胞率为6.74%;2-细胞期克隆胚移植假孕受体后,没有获得怀孕受体。试验分别以“血清饥饿”胎儿成纤维细胞、新鲜细胞和冷冻保存细胞为供体作核移植,结果表明,冷冻保存细胞的融合率(69.3%)与其余两组(80.6%和84.8%)呈显著差异(P<0.05);激活率、2-细胞和4-细胞发育率,则三组间差异不显著(P>0.05)。本研究将化学去核与无透明带技术相结合,完全丢弃了传统核移植的显微操作及其繁琐程序,属手工克隆,它的成功将会大大简化核移植程序,同时提高了核移植的生产力,最终提高核移植总效率。     

玻璃化冷冻牛卵母细胞单精子注射后体外发育能力的研究

实验研究了不同成熟培养时间的牛卵母细胞玻璃化冷冻及胞质内单精子注射(ICSI)后的受精效果。结果表明:成熟后的新鲜牛卵母细胞按照ICSI注射方法穿刺而不注射精子组与未经穿刺的对照组相比,孤雌激活后的卵裂率、囊胚发育率及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05);成熟培养16h(MⅠ)和23h(MⅡ)卵母细胞冷冻解冻后形态正常率均显著低于新鲜对照组(76.66%、87.33%vs100.0%)(P<0.05),冷冻解冻后二者分别成熟培养至24h,ICSI后胚胎的囊胚发育率(5.29%、14.41%)显著低于新鲜对照组(24.40%)(P<0.05);成熟培养23h与成熟培养16h的卵母细胞冷冻解冻后形态正常率及ICSI后囊胚发育率(14.41%vs5.29%)均有显著性差异(P<0.05)。实验证明,ICSI操作不会影响卵母细胞发育潜力;玻璃化冷冻影响卵母细胞解冻后形态正常率以及ICSI后胚胎的发育能力;成熟培养23h比16h的卵母细胞冷冻保存后经ICSI的胚胎发育潜力高。     

转基因奶牛胚胎移植技术的试验研究

2006年6月至2010年3月以来,北京奶牛中心与中国农业大学合作,在北京奶牛中心良种场开展了转基因牛胚胎移植试验研究。本试验利用中国农业大学培育的转基因母牛作为供体,进行超数排卵生产体内胚胎,将获得的胚胎移植给15～15.5月龄荷斯坦母牛受体。截止2010年3月21日,累计移植转基因奶牛胚胎87枚,移植受体牛87头,妊娠48头,移植妊娠率为55.17%;产犊43头,成活34头,犊牛成活率为79%;经中国农业大学研究人员检测,有14头公牛携带转入目的基因,这14头公牛已全部进入北京市种公牛站饲养。目前,有10头公牛到了试采精月龄,精液经农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(北京)检测,质量符合国家标准。     

牛活体采卵技术研究进展

活体采卵(Ovum Pick-up,OPU)可生产大量遗传品质优良、系谱明确的体外受精胚胎,成为牛胚胎移植的重要胚胎来源,在奶牛和肉牛生产中得到广泛应用。本文综述了牛OPU技术特点和优势,重点分析了影响OUP效率的因素,以期为牛OUP胚胎生产提供参考。     

无血清培养基IVD101和G1/G2在牛体细胞核移植中的应用研究

通过考察牛体细胞核移植重构胚在无血清培养基（IVD101、G1／G2）条件下培养的囊胚发育率及其质量,从而评估无血清培养基支持牛体细胞核移植重构胚体外发育的能力。采用IVD101和G1／G2对牛体细胞核移植胚胎进行体外培养,并以CR1aa＋5％FBS作为对照组。无血清培养基IVD101和G1／G2的囊胚发育率与对照组无显著性差异（41．2％&#177;9．1％、42．2％&#177;10．8％,48．0％&#177;9．2％,P〉0．05）。通过囊胚差异染色和冷冻／解冻胚胎存活率分析胚胎质量,发现无血清培养基ICM／Total略低于对照组（31．8％&#177;10．5％、29．5％&#177;11．9％vs ．33．0％&#177;14．8％）,但无显著性差异（P〉0．05）;3个组别的囊胚经程序化冷冻／解冻后无血清培养基的存活率（IVD101、G1／G2）略高于对照组,但差异不显著（84．8％、80．4％＇US．77．3％,P〉0．05）。结果证明无血清培养基（IVD101、G1／G2）可以支持体细胞核移植重构胚的体外发育,且其对程序化冷冻的耐受性与添加血清组（CR1aa＋5％FBS）相似。     

鲁西黄牛体细胞克隆保种技术的研究

以体外培养的鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞作核供体，研究利用体细胞克隆技术保存我国地方黄牛优良品种的技术方法。通过组织块培养法建立的鲁西黄牛（1♂，4♀）成纤维细胞系，作为核移植供体细胞，利用屠宰场母牛卵巢卵母细胞经体外培养成熟后作为核受体进行核移植，试验结果表明：重构胚的融合率为62．5％（242／387），分裂率为63．6％（154／242），体外培养第7天囊胚发育率为42．9％（66／154）。体外培养第7天的囊胚的内细胞团细胞（ICM）与滋养层细胞数平均为37和47，ICM占44．2％。体外发育到7d的囊胚新鲜胚胎的移植妊娠率（新鲜胚胎）移植受体10头，60d妊娠率为20％（2／10）。     

低氧对牛体细胞体外增殖的影响

本研究通过比较常氧(20%)和低氧(5%)环境下培养牛体细胞的生长效果,进而探讨低氧对牛体细胞体外增殖的影响。选用牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞)分别在常氧和低氧2种培养环境下进行连续传代培养和细胞克隆培养,并对其倍增水平和细胞克隆形成效率作比较分析。结果显示,5%的低氧环境对这3种细胞的体外增殖均有促进效果,而且各细胞的增殖水平(50.61±2.47、16.35±0.43、43.38±0.84)均显著高于常氧组(27.42±0.23、12.14±0.83、32.76±1.53,P<0.01)。以500个·皿-1(直径100mm)的细胞浓度接种培养的情况下,低氧培养的胎儿输卵管上皮细胞的克隆形成效率((53.05±4.62)%)显著高于常氧组((36.68±5.68)%)(P<0.01),而低氧组胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞获得的细胞克隆数只是略多于常氧组,差异并不显著(P>0.05)。当以1个.孔-1的细胞浓度接种于96孔板培养时,低氧组各类细胞的单细胞克隆形成效率((21.60±2.37)%、(22.29±5.42)%、(27.92±3.69)%)显著高于常氧组((12.01±1.42)%、(7.92±2.86)%、(10.49±3.07)%)(P<0.01或P<0.05)。将体外培养条件的常氧含量(20%)调减至更接近体内生理状况的低氧含量(5%)可以延长牛体细胞增殖寿命和提高单细胞克隆形成效率,对细胞生长有很好的促进作用。     

不同转染方法转染牛体细胞效率的比较

为了从新转染方法与传统转染方法的比较中找出更为高效的转染方法,本研究以绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA为外源基因,分别采用核转染法、电穿孔法和脂质体法转染牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞).针对不同类型的细胞,实验首先对核转染法和电穿孔法的转染参数进行了系统的摸索和优化,然后将优化后的核转染法、电穿孔法与脂质体法在可控实验条件完全一致的情况下进行了转染对比实验,分析比较了转染48 h后的绿色荧光比率和细胞存活率.结果显示,核转染法转染胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞和卵丘颗粒细胞的优化程序分别是V013、T023和U023;在电穿孔法中,当电场强度为90 V/mm,脉冲时间为10 ms时,胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞的转染效率最高,胎儿输卵管上皮细胞则在电场强度为80 V/mm,脉冲时间为5 ms时获得了最佳转染效率;最后通过转染对比实验得出,核转染法在3种细胞中都获得了最高的转染效率,分别为(98.78±0.30)％、(88.43±2.10)％和(71.31±0.77)％,均显著高于电穿孔法和脂质体法;转染后的存活率则为脂质体法最高,电穿孔法最低.研究结果说明,核转染法可以成为一种结合牛体细胞克隆技术生产转基因牛更有效的转染方法.     

转基因牛与非转基因牛性控精液分离及配种效果初探

本研究对转基因牛以及非转基因牛精液经流式细胞仪分离冷冻后精子活力、分离准确率进行了比较,同时对分离的性控冷冻精液进行了人工输精,对受体牛的情期受胎率进行了统计分析。结果表明,转基因牛与非转基因牛精液在冷冻解冻后活力以及分离准确率方面差异不显著(P>0.05);转基因牛与非转基因牛的性控冷冻精液的情期受胎率分别为57.4%、59.3%,二者之间差异不显著(P>0.05)。     

发情牛血清在猪卵母细胞成熟中的应用

为了检验发情牛(Bos taurus)血清在猪卵母细胞成熟中的应用,实验分别在成熟培养液中加入不同的血清,观察卵母细胞的成熟效果,并通过孤雌激活胚胎和重构胚的体外发育能力来判断血清对卵母细胞质量的影响:研究还进行了用发情牛血清成熟的卵母细胞构建的核移植胚胎的体内发育试验.结果表明,发情牛血清,成年牛血清和胎牛血清在猪卵母细胞的成熟率方面没有显著差异(P>0.05);卵母细胞成熟时加入不同的血清,对卵母细胞体外发育能力的影响不显著(P>0.05);来自含发情牛血清成熟液培养的卵母细胞,与胎儿成纤维细胞构建的克隆胚胎能够完成全期发育.