核转染技术转染水牛细胞的初步研究

本研究旨在获得一种高效转染水牛细胞的方法。本研究首先以水牛胎儿成纤维细胞（BFF）为研究对象,建立、优化核转染法;随后,比较核转染法、脂质体法、电穿孔法转染BFF的效率;最后选用较优的方法,探讨转染水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞的可行性。结果发现随电压的增加,核转染BFF的效率升高;核转染电压为225V,脉冲时间为10ms时,细胞EGFP阳性率为（83.1±1.4）%,转染效率显著高于脂质体法（（11.7±1.2）%）和电穿孔法（（35.5±2.0）%）。运用优化的核转染条件可以成功将外源基因导入水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞,且不影响其细胞生物学特性。本研究为以多能干细胞介导的水牛转基因克隆胚胎的生产奠定了基础。     

转染方法对肌肉生长抑制素基因敲除载体转染效率的影响

本研究主要探讨转染方法对不同细胞系的转染效果。实验采用电穿孔和脂质体转染方法，将线性化的绵羊肌肉生长抑制素基因（myostatin）药物正负筛选（PNS）打靶载体pLoxp-1．4K-4．3KDNA导人体外培养的绵羊胎儿和成年绵羊耳部成纤维细胞中，而后采用G418和GANC进行药物抗性细胞克隆筛选和培养。结果发现，脂质体法对myostatin基因敲除载体的转染效果明显优于电击法，但电穿孔法对细胞类型的依赖性较小；采用与载体基因型相同的细胞系，两种转染方法的转染效率均略高于对照成年绵羊成纤维细胞系。     

猪核移植供体细胞的分离培养及传代的研究

通过对猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代的研究,摸索出一套猪体细胞的分离、培养和传代的方法,建立了猪的供体细胞系。研究结果表明:猪的卵丘细胞单层的生长需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞,组织块法单层的生长需要10~11 d,酶消化法需要8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些供体细胞培养方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞材料来源。     

牛皮肤成纤维细胞的分离培养与人溶菌酶基因的转染研究

摘要：为得到转染人溶菌酶基因的核供体细胞,采用组织块贴壁法分离培养牛耳成纤维细胞,经传代纯化培养,绘制生长曲线,将纯化好的带有人溶菌酶和绿色荧光标记基因的载体用脂质体法转入第4代成纤维细胞。24 h后荧光显微镜下检测到有绿色荧光蛋白表达,经500mg/ml G418筛选2周后,G418减半继续培养2～3代 ,PCR检测到有目的条带,说明目的基因已成功导入,因此本研究中获得的转基因牛耳成纤维细胞可能作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究。     

脂质体法构建广西巴马小型猪转基因体细胞及转基因克隆胚的生产

脂质体法是一种传统的向哺乳动物细胞导入外源基因的方法,然而其转染效率受多种因素影响。本研究将从脂质体和质粒DNA量、转染暴露时间以及混合孵育时间等四方面进行探索,以寻找最佳的转染体系。试验结果表明最佳转染体系为：脂质体1.25μL、DNA 0.7μg、脂质体-DNA混合孵育0 min以及转染暴露6 h。随后我们用优化过的转染体系对新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞进行转绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）操作,获得了（26.45±2.11）%的转染率,并以此为核供体经体细胞核移植技术成功构建表达GFP的广西巴马小型猪克隆胚胎,同时证实转基因克隆胚的体外发育能力比得上非转基因克隆胚。这为我们构建用于人类疾病研究的基因修饰广西巴马小型猪奠定了基础。     

电转染法制备奶牛转溶葡球菌酶(Lysostaphin)和内溶素(Endolysin)基因胚胎

溶葡球菌酶(Lysostaphin)是一种含锌的单链蛋白酶,能有效地杀灭金黄色葡萄球菌.内溶素(Endolysin)是双链DNA噬菌体所特有,是一类胞壁质水解酶,具有广泛的抗菌效果.内溶素与抗生素之间有高效的协同作用.本研究通过BTX电转染和AMAXA核转染的方法将含有溶葡球菌酶(Lysostaphin)和内溶素(Endolysin)两个目的基因(Seq2和Seq3)及绿色荧光蛋白(enhencedgreenfluorescent protein,EGFP)和新霉素(neomycin,neo)两个标记基因的载体pBC1-seq2+seq3-EGFP-neo,导入牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞,经荧光观察、G418筛选和PCR鉴定后建立稳定转染的单克隆阳性细胞系.以其作为核供体,体细胞核移植制备转基因胚胎.通过4组不同转染程序(A-023,V-013,V-023和T-016)转染牛胎儿成纤维细胞,结果表明,转染参数T-016最适合本实验,其AMAXA转染效率(20.11％)为BTX电转染转染效率的5倍.转基因囊胚率为(20.08±4.19)％,并发育正常.本研究建立了牛胎儿成纤维细胞系,筛选出高效的转染参数,并获得了含溶葡球菌酶、内溶素的转基因细胞系和转基因囊胚,为制备抗乳房炎转基因牛及寻找防治奶牛乳房炎新途径提供了技术支持.     

供体核种类对水牛核移植效果的影响

采用电融合法和直接注射法进行核移植,以比较不同来源和不同类型水牛供体细胞的核移植效果。当用电融合法进行核移植时,成体耳部成纤维细胞的融合率(46.0%)、卵裂率(53.9%)和囊胚发育率(10.9%),均显著低于胎儿成纤维细胞(64.5%,70.1%和21.6%)、胎儿皮肤细胞(71.5%,70.8%和22.1%)以及卵巢颗粒细胞(88.2%,79.1%和25.5%);后三种细胞间的卵裂率和囊胚发育率无显著差异,但卵巢颗粒细胞的融合率显著高于胎儿成纤维细胞和胎儿皮肤细胞(P<0.05)。当用直接注射法进行核移植时,胎儿皮肤细胞注核后的存活率(78.2%)、卵裂率(41.6%)均显著低于成体耳部成纤维细胞(88.6%和57.4%)和胎儿成纤维细胞(85.8%和65.0%)。胎儿成纤维细胞注核后的卵裂率和囊胚发育率(23.3%)均显著高于胎儿皮肤细胞(10.1%)和成体耳部成纤维细胞(12.0%)。结果表明:(1)采用直接注核法进行核移植时,胎儿成纤维细胞作为核供体较为合适,而采用电融合法进行核移植时,用颗粒细胞作核供体更为适宜;(2)胎儿成纤维细胞的核移植效果好于成体成纤维细胞。     

脂质体介导pAcGFP-bFADD重组质粒转染Hela细胞条件的优化

用脂质体lipofectamine 2000介导携带有AcGFP报告基因的pAcGFP-bFADD质粒转染Hela细胞,并通过调整质粒DNA、脂质体的浓度及转染时间来优化转染条件,转染后12h在荧光显微镜下计数阳性细胞,MTT法检测各转染条件下Hela细胞的活性。结果表明,将2.4μg的pAcGFP-bFADD质粒与3.0μL lipofectamine 2000制备转染复合物与Hela细胞作用6h可以获得62.3%的转染效率,并且保持较高的细胞存活率（83%）。当质粒DNA与脂质体的量增加至3.2μg和6.0μL时,转染复合物对细胞的毒性作用明显增强,对细胞的抑制率可达42.98%,与对照组相比,差异极显著（P〈0.01）;条件优化后AcGFP-bFADD融合基因于转染后72h达到表达高峰,绿色荧光阳性细胞所占比率达到64%。     

供体细胞种类对牛核移植效果的影响

供体细胞种类对牛卵母细胞核移植效果影响的研究结果表明,颗粒细胞的核移植效果与成年牛成纤维细胞无显著差异(19.8%vs 17.3%,P>0.05);胎牛成纤维细胞核移植囊胚发育率高于成年牛成纤维细胞(24.2%vs 14.0%,P<0.05);血清饥饿处理的胎牛成纤维细胞(休眠细胞)与高血清培养(非休眠细胞)的胎牛成纤维细胞核移植效果差异不显著(18.8%vs 18.6%,P>0.05),表明胎牛成纤维细胞血清饥饿处理没有必要。     

STAT3基因转染牛乳腺上皮细胞及生物学特性观察

应用PCR技术从含有人STAT3基因cDNA的质粒pOTB7中扩增STAT3基因片段。将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达质粒。利用脂质体介导法将重组表达质粒转染原代牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Epithelial cells)。G418筛选阳性克隆,RT-PCR检测STAT3基因在牛乳腺上皮细胞中的表达情况,并通过流式细胞术(Flow cytometry)检测转染细胞的增殖能力、周期以及DNA含量。结果表明,转染24h后大约16%的细胞被导入含STAT3基因的重组表达质粒。在mRNA水平证实细胞内有STAT3基因的高表达。导入STAT3基因后,细胞增殖能力增强,染色体倍数发生变化,细胞的增殖寿命较对照细胞延长了13代,表明导入STAT3基因后,能延长体外培养的牛乳腺上皮细胞的寿命。     

猪microRNA-378-1过表达载体构建及细胞水平验证

microRNA对细胞的增殖和分化有着重要的调节作用,从大白猪(Susscrofa)基因组DNA上扩增microRNA-378-1前体序列,经XhoⅠ酶切后回收相应片段,连接到pEGP-miR载体中,构建重组载体pEGP-miR-378-1,转染猪胎儿成纤维细胞系(PEF),通过荧光观察转染效率及报告基因的表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内microRNA-378-1的表达活性。结果表明,成功地构建了重组载体pEGP-miR-378-1;荧光观察转染后的细胞,显示有较高的转染效率,报告基因有较高的表达效率;QRT-PCR结果显示,实验组和对照组microRNA-378-1表达显著提高,实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01);为制备转基因动物研究microRNA-378-1功能提供技术平台。     

金华猪胎儿成纤维细胞系的建立与生物学特性分析

建立并保存家畜的成纤维细胞在保护畜禽种质资源研究中发挥着重要作用。本研究以40日龄金华猪胚胎为实验材料,采用组织贴壁法建立了金华猪胎儿成纤维细胞系,并对所建细胞系进行生物学特性研究。结果表明,原代细胞生长迅速,贴壁后2~3d可长满培养瓶,获得的成纤维细胞生长态势良好;细胞生长曲线为典型的S形,细胞群体倍增时间(population doubling time,PDT)约为36h;细胞冻存前、复苏后的活率分别为95.2%和92.8%;细胞中期染色体二倍体(2n=38)占主体约为91%,达到了建立成纤维细胞系的要求;苹果酸脱氢同工酶(malic dehydrogenase,MDH)和乳酸脱氢同工酶(lactic dehydrogenase,LDH)电泳结果表明,本细胞系没有被其他细胞污染,细胞纯度较高;细菌、真菌和支原体三类微生物检测结果均为阴性,细胞没有受到微生物的污染;15代细胞的凋亡率为2.0%,细胞没有大规模的凋亡现象发生;当阳离子脂质体(Lipofectamine2000)剂量为0.3μL、荧光蛋白报告质粒(pEGFP-N3)为0.5μg时转染成纤维细胞的效率最高,可达32.4%。细胞系各项指标均达到美国典型培养中心(American Type CultureCollection,ATCC)标准。金华猪胎儿成纤维细胞系的成功建立使金华猪种质资源在细胞水平得到保存,并可为胚胎克隆以及转基因等研究提供必要的实验材料;也可以为以后其他种质资源在细胞水平上的保存提供理论与技术支持。     

四环素诱导型单载体的构建、体外表达与鉴定

pTet-on-Advanced双载体表达系统应用于转基因动物研制,需要建立两种动物品系,经过杂交和筛选,才有可能得到转基因个体,操作繁琐,转化效率低。本研究在改良的四环素(Tet-on)基因可调控系统基础上,通过PCR的方法,分别从pTet-on-Advanced质粒和pEGFP-N1质粒中扩增rtTA和EGFP基因,测序正确后,将rtTA和EGFP基因亚克隆入pTRE-Tight载体中,构建四环素pTRE-Tight-rtTA-EGFP单载体表达系统,然后采用脂质体法,将新构建的单载体表达体系pTRE-Tight-rtTA-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞,以不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1和1g/L)强力霉素(Dox)诱导,通过荧光显微镜检测EGFP的表达量。结果显示,转染48h后,未加Dox无绿色荧光表达;1g/LDos诱导可以观察到绿色荧光;Dox浓度分别为0.0001、0.001、0.01和0.1g/L未观察到绿色荧光。表明1g/LDox才能激发调控作用。本研究成功构建pTRE-Tight-rtTA-EGFP新型可控性真核表达载体,该载体在细胞中的表达受Dox的调控,能正常发挥作用。研究结果为转基因的定量表达提供了新的技术平台,也为将构建的单载体用于表达可控的转基因动物研究提供了重要科学依据。     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞研究

提取第28 期鸡胚性腺中的原始生殖细胞(PGCs)，将其与性腺基质细胞共培养，并对PGCs 进行PAS (过碘酸希夫试剂) 和AKP(碱性磷酸酶) 染色鉴定。构建pLenti-CMV-eGFP 慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293FT 细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs，转染率高达24.19 %。实验还比较了慢病毒不同剂量对转染效率的影响，随着慢病毒剂量的增加，转染效率显著提高。     

第三代慢病毒高效率包装系统的建立

慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一,高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键。本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）的第3代慢病毒载体系统,用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T包装细胞,培养48-72h收集病毒上清液,通过超速离心进行浓缩,采用批量快速测定法（LaSRT）定病毒滴度。结果显示,用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T细胞,经检测病毒滴度达到5×10^8IU／mL以上,初步建成了高滴度慢病毒包装平台,为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础。     

梅岭土鸡原始生殖细胞的生物学特性

作为精原细胞和卵原细胞的祖细胞,由于其全能性的特点可作为体外胚胎发育研究的良好模型,而禽类独特的生理和发育特点使得其原始生殖细胞(PGCs)在转基因研究中有着巨大价值。本研究通过对孵化5.5d的梅岭土鸡(Gallus domesticus)胚生殖腺中分离得到的PGCs,接种于24孔培养板在温度37℃、95%空气和5%CO2的培养箱中进行体外培养;借助组织化学及免疫组织化学染色对PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)、SSEA-1(胚胎阶段特异性表面抗原-1)以及TERT(端粒酶反转录酶)进行了鉴定;采用荧光定量PCR技术对PGCs阶段特异性表达基因Cvh(鸡Vasa基因同系物)、Cdh(鸡死端同系物)、Dazl(类无精症缺失)和干细胞多能性相关基因PouⅤ(POU结构域Ⅴ类转录因子1)、Nanog(nanog同源异型盒)、Sox-2(性别决定区Y盒2)基因表达进行了分析;利用脂质体介导法,将绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因导入鸡PGCs细胞,结果表明,PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP、SSEA-1以及TERT染色阳性;PGCs阶段特异性表达基因Cvh、Cdh、Dazl和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox-2在鸡PGCs中均远远高于在鸡成纤维细胞(CEF)中的表达;转染24h后,绿色荧光蛋白均匀的充满细胞质和细胞核,转染效率最高为16%,研究结果为禽类PGCs分化过程中基因调控及基因标记、转基因动物克隆等技术提供了良好基础。