牛体外受精卵的二步法培养体系的研究

以CR1aa为基础培养液,采用二步法对牛体外受精卵进行体外培养,完善牛体外受精卵的培养体系.实验一:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa 3 mg/mLBSA培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的囊胚率显著高于对照组,但卵裂率和囊胚孵化率无显著差异.实验二:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS培养,处理组前3 d为CR1aa培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS.处理组的卵裂率显著高于对照组,但囊胚率和囊胚孵化率差异不显著.实验三:对照组连续7 d均为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1mmol/L GSH培养,处理组前3 d为CR1aa 0.1 mmol/L GSH培养,后4 d换为CR1aa 50 mL/L FBS 0.1 mmol/L GSH.处理组的卵裂率显著高于对照组,囊胚率极显著高于对照组,但囊胚孵化率差异不显著.结果表明,GSH与二步法培养系统结合相对于传统的一步法培养系统更适于牛体外受精卵的体外培养.     

不同培养液及血清浓度对绵羊孤雌生殖胚胎发育的影响

体外成熟的绵羊卵母细胞，经5 μmol/L A23187 5 min和2 mmol/L 6-DMAP 4 h激活后，分别在SOFaa、M-199两种培养液中进行培养，试验比较了SOFaa、M-199液分别添加BSA和不同浓度（10%、20%）胎牛血清对绵羊孤雌生殖胚体外发育的影响。M-199+FCS组的卵裂率显著低于SOFaa+BSA和SOFaa+FCS组（P<0.05），SOFaa+BSA组的囊胚率显著低于M-199+BSA、SOFaa+FCS、M-199+FCS三组（P<0.05）；SOFaa+10% FCS与SOFaa+20% FCS组的卵裂率及囊胚率均无显著差异，M-199+10% FCS和M-199+20% FCS组的卵裂率及囊胚率间均无显著差异。结果表明：SOFaa比M-199更适合绵羊孤雌生殖胚体外发育，此外添加10%的FCS即可达到较好的培养效果。     

牛、羊卵母细胞孤雌激活的研究

主要比较了离子霉素、电脉冲及培养基更换对牛羊体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响。两种方法对牛胚胎的研究中,牛胚胎卵裂率无显著差异(90.61%vs94.40%,P>0.05),而离子霉素激活胚胎的囊胚发育率极显著高于电激活方法(12.3%vs2.4%,P<0.01)。两种方法对羊胚胎的研究中,羊胚胎卵裂率无显著差异(72.4%vs77.4%,P>0.05)。但是离子霉素激活胚胎的囊胚发育率显著高于电激活方法(3.67%vs10.4%,P<0.05)。本试验还采用两种方法来培养牛化学激活孤雌胚。方法一是把化学激活牛体外成熟卵母细胞放于SOFaa(Synthetic Oviduct Fluid aa)培养基中连续培养7d;方法二是把化学激活牛体外成熟卵母细胞放于SOFaa培养基中4 d后,再转移进入含有10?S(Fetal Bovine Serum)的SOFaa培养基中继续培养3 d。试验结果表明:方法一中的囊胚发育率显著高于方法二(11.64%vs3.49%,P<0.01)。这也说明了更换培养基不利于其体外囊胚发育率。     

山羊卵母细胞孤雌激活及孤雌胚的体外培养

为了比较不同的激活方法对卵母细胞孤雌激活的影响,以及培养液(CR1aa)中添加不同类型的血清对孤雌激活胚体外发育的影响。采用Eth 6-DMAP、A23187 6-DMAP和Ion 6-DMAP三种方法激活山羊卵母细胞,Eth 6-DMAP组孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率(35.2%和4.8%)显著低于A23187 6-DMAP组(68.9%和24.1%)和Ion 6-DMAP组(88.1%和48.0%),表明以Ion 6-DMAP激活最为理想。在培养液(CR1aa)与颗粒细胞共同培养条件下,分别添加100 mL/L的发情牛血清(OCS)、胎牛血清(FBS)和新生牛血清(NCS)。添加OCS和FBS后,孤雌胚囊胚率分别为48.1%和45.0%,显著高于添加NCS组(26.0%)。表明OCS、FBS和NCS能有效的提高孤雌胚的体外发育能力,尤其是对提高孤雌胚的囊胚发育能力更佳。     

黄淮白山羊孤雌胚胎的体外培养

采用离子霉素和6-DMAP对黄淮白山羊体外成熟卵母细胞进行联合激活,分别在不同的培养体系进行体外培养,观察孤雌胚胎的发育情况。培养体系分别为:无共培养条件下,M199(10?S)、CR1aa和HTF P1;颗粒细胞共培养条件下,CR1aa、HTF P1和SOFaa。结果发现,无共培养条件下,CR1aa和HTF P1组孤雌胚胎的卵裂率显著高于M199组(P<0.05),但3组均未有囊胚;共培养条件下,HTF P1组的卵裂率显著高于CR1aa和SOFaa组(P<0.05),而CR1aa组的囊胚率却显著高于其他2组(P<0.05)。综合试验结果说明,CR1aa联合颗粒细胞共培养能够获得较好的培养效果,适用于山羊孤雌胚胎的体外培养。     

FBS和不同养液对牛孤雌胚体外发育的影响

研究培养液中血清的添加时间和添加浓度及不同培养体系对牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响.结果表明:牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天添加10%的FBS对孤雌胚的体外发育效果良好.4 种培养体系在孤雌激活后的第3天添加10%的FBS,平均囊胚率分别可达46.25%(SOFaa)、43.58%(CRlaa)、40.25%(KSOMaa)、17.98%(TCM199);TCM199组的囊胚率显著低于其他3组(P＜0.05),SOFaa优于CRlaa和KSOMaa组,但差异不显著(P＞O.05).     

山羊胚胎体外培养条件的优化

为优化山羊胚胎体外培养条件,本试验比较了含有3种不同来源血清（优质胎牛血清、发情山羊血清、前列腺素（PG）处理后发情山羊血清）的M199对卵母细胞成熟效果的影响,成熟率分别为65.95%、49.2%、76.47%,差异极显著（P＜0.01）;本试验还分别采用了SOFaa、CR1aa+输卵管上皮细胞共培养,以及改进的DMEM/F12发育体系培养受精卵,结果发现,SOFaa、CR1aa+输卵管上皮细胞的发育培养系统得到的囊胚率为29.62%、24.73%,差异不显著(P＞0.05),改进的DMEM/F12发育液囊胚率最高为48.42%,差异极显著（P＜0.01）。     

CR1aa-卵丘细胞共培养牛体外受精卵的卵裂率及囊胚率

牛卵母细胞用5％CS的TCM－199培养液体外成熟培养（IVM）22h；以BO液＋咖啡因作精子获能处理1.5h；BO液＋BSA的培养液体外受精（IVF）5h；受精卵（含卵丘细胞）用5％CS的CR1aa培养液在5％CO2、955空气、38.5℃、饱和湿度的培养环境中体外培养（IVC）7－8d，结果受精卵裂率为72.4%（56.3%－81.0%），囊胚率23.7%(12.5%-40.9%）。     

四种培养液对牦牛孤雌胚胎发育的影响

为探讨不同培养液对牦牛早期胚胎发育的影响,本试验将经过孤雌激活后的牦牛卵母细胞分别置于m SOF,G1/G2,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养四种体外培养液中进行体外培养。结果表明,四种培养液对胚胎的卵裂率影响差异不显著,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚率显著高于m SOF和G1/G2组,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚率之间没有显著差异,但是CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚孵化率显著高于CR1aa组,说明CR1aa颗粒细胞共培养可作为较为合适的牦牛早期胚胎培养液。     

牛体外受精早期胚胎培养体系优化的研究

研究旨在筛选牛体外受精的最优培养体系,提高体外受精的囊胚孵化率。本研究将培养体系分为四组,CR1aa组,mCR组,CR1aa前+mCR后组,mCR前+CR1aa后,通过统计胚胎发育情况。结果显示CR1aa组卵裂率,八细胞率,囊胚率,孵化率分别为82.29±0.58,48.79±1.12,24.99±0.28,14.42±0.86;mCR组卵裂率,八细胞率,囊胚率,孵化率分别为57.18±1.61,26.48±0.53,22.15±1.20,18.12±0.57;CR1aa前+mCR后组卵裂率,八细胞率,囊胚率,孵化率分别为82.24±1.32,48.60±1.93,34.07±1.04,24.87±0.66;mCR前+CR1aa后组卵裂率,八细胞率,囊胚率,孵化率分别为58.80±2.26,26.77±1.21,24.15±0.73,13.10±1.09;从四组结果中可以看出CR1aa前培养液与mCR前相比可以显著提高牛体外受精的卵裂及八细胞率(P0.05),但其后期发育不佳。mCR后与CR1aa后相比可以显著提高牛体外受精胚胎的囊胚率和孵化率(P0.05)。由此得出mCR前+CR1aa后组可以显著的提高体外受精的囊胚和孵化率。为了进一步验证该组合的稳定性,利用mCR前+CR1aa后体系分别在不同季节进行验证,结果显示除夏季相对不佳外,其他季节均能维持较高的卵裂囊胚孵化率。进而认为CR1aa前+mCR后体系最有利于牛体外受精胚胎的生产且孵化率较高,有利于后期胚胎移植的进行。     

Different factors affect developmental competence and cryotolerance in in vitro produced bovine embryo

The present study was conducted to examine the effects of culture systems and culture media on developmental competence and freezability of bovine embryos obtained by in vitro culture of in vitro matured and fertilized (IVM-IVF) oocytes. No significant difference was observed in the proportions of oocytes developed to blastocysts, the speed at which the oocytes reached the blastocyst stage and the number of cells, when the IVM-IVF oocytes were cultured in CR1aa with or without cumulus cells. Nevertheless, more of the IVM-IVF oocytes cultured either with or without cumulus cells in CR1aa were seen to reach the blastocyst stage much sooner than those cultured with cumulus cells in TCM199 (P<0.05). The proportion of embryos developed to the blastocyst stage by day 7 in CR1aa culture was significantly higher than embryos cultured in TCM199. Viability after frozen-thawed blastocysts were obtained in vitro, was seen in a significantly higher percentage of embryos cultured in TCM199 and developed to the hatched blastocysts than in those cultured in CR1aa (P<0.05). These results indicate that CR1aa was superior to TCM199 for the potential developmental of IVM-IVF oocytes to blastocysts during in vitro culture regardless of co-culture with or without cumulus cells. But the freezability of blastocysts developed in CR1aa was inferior to those developed in TCM199.     

Development of bovine embryos cultured in CR1aa and IVD101 media using different oxygen tensions and culture systems

The aim of the present study was to optimise the culture conditions for the in vitro production of bovine embryos. The development of in vitro fertilised bovine oocytes in CR1aa supplemented with 5% calf serum and IVD101 culture media were compared using traditional microdrops and Well of the Well (WOW) culture systems either under 5% or 20% oxygen tension. After 7 days of culture, a significantly higher blastocyst formation rate was obtained for embryos cultured in CR1aa medium compared to those cultured in IVD101, irrespective of O2 tensions and culture systems. The blastocyst formation in IVD101 was suppressed under 20% O2 compared to 5% O2 . Despite their similar total cell numbers, higher rates of inner cell mass (ICM) cells were observed in blastocysts developed in IVD101 medium than in those developed in CR1aa, irrespective of O2 tensions. There was no significant difference in blastocyst formation, total, ICM and trophectoderm (TE) cell numbers between embryos obtained by microdrop and WOW culture systems irrespective of the culture media and O2 tensions used. In conclusion, CR1aa resulted in higher blastocyst formation rates irrespective of O2 tension, whereas IVD101 supported blastocyst formation only under low O2 levels but enhanced the proliferation of ICM cells.     

不同共培养体细胞和胎牛血清浓度对牛体外受精后早期胚胎的影响

利用屠宰黄牛的卵母细胞经体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)后的早期胚胎,与单层颗粒细胞(GC)、输卵管上皮细胞(BOEC)等体细胞共培养及在胎牛血清的胚胎培养液中的后续发育进行了研究,并探讨了其影响因素,以期筛选出最佳的体外培养条件。结果表明:使用GC和BOEC体外共培养牛体外受精后胚胎,均取得了较好的囊胚发育率;且牛体外受精后早期胚胎体外培养体系中,添加10%血清能有效地促进牛体外受精后胚胎的囊胚率。     

奶牛活体采卵-体外受精效率的影响因素研究

为建立稳定高效的活体采卵-体外受精技术体系,提高体外胚胎生产效率,本研究先利用屠宰场采集的新鲜卵巢卵母细胞进行体外受精,通过胚胎发育潜力来筛选最佳的体外胚胎培养液;再进一步研究不同种公牛精液和供卵母牛对活体采卵-体外受精效率的影响。结果显示,CR1aa培养液和mCR1aa培养液卵裂率差异不显著（P>0.05）,但mCR1aa组的囊胚发育率显著提高（28.1% vs 20.6%,P<0.05）;选取的3头荷斯坦种公牛精液的活体采卵-体外受精胚胎的卵裂率差异不显著（P>0.05）,但1号种公牛精液体外受精后囊胚率（38.7%）显著高于2号和3号（23.8%&22.9%）（P<0.05）;随机选择的3头活体采卵供体母牛（H1、H2、H3）获得的头均可用卵母细胞数无显著差异,但H1和H2供体母牛体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显著高于H3供体牛（P<0.05）,且H1供体牛体外受精囊胚率显著高于H2供体牛（P<0.05）。结果表明,mCR1aa培养液能显著提高体外受精囊胚发育率,适用于体外胚胎生产;种公牛精液和供体母牛个体差异会直接影响活体采卵-体外受精胚胎的生产效率,为奶牛活体采卵-体外受精生产技术体系的优化提供参考。     

不同培养体系对胎牛成纤维细胞体外培养的影响

研究不同培养体系对胎牛成纤维细胞体外培养的影响及用牛血清白蛋白代替血清培养胎牛成纤维细胞的可行性。利用M199、DMEM、α-MEM、DMEM/F124种培养体系通过组织块贴壁培养对成纤维细胞体外培养液进行筛选,以α-MEM组细胞生长状况较好。分别用含2、4、6、8、10mg/mL BSA的α-MEM培养液对胎牛成纤维细胞进行原代及传代培养,5种浓度的BSA对原代培养时细胞开始游离出组织块的时间影响不明显,均在培养后的48h有成纤维细胞和上皮细胞混合游离出,但在传代培养时,胎牛成纤维细胞在8mg/mL BSA浓度的α-MEM中贴壁率较高。结果表明:培养胎牛成纤维细胞时,可用BSA代替血清,较适宜的培养体系为含8mg/mL BSA的α-MEM培养液。     

转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。     

不同收集方法及添加半胱氨酸、肝素钠对黄牛卵母细胞体外成熟及发育的影响

试验旨在研究不同卵母细胞收集方法及添加半胱氨酸、肝素钠对黄牛卵母细胞体外成熟及体外受精的影响。以黄牛为研究对象,采用两种方法（抽卵法和割卵法）抽取卵泡中的卵母细胞,比较两种方法获取的卵母细胞成熟率,结果发现,抽卵法获得的卵母细胞成熟率显著高于割卵法（P<0.05）。将获取的卵母细胞分为4组：A组（对照组,只添加基础成熟培养液）、B组（基础成熟培养液+200 μmol/L半胱氨酸）、C组（基础成熟培养液+20 μg/mL肝素钠）、D组（基础成熟培养液+200 μmol/L半胱氨酸+20 μg/mL肝素钠）,结果发现,D组的卵母细胞成熟率显著高于A、B、C组（P<0.05）,B、C组间卵母细胞成熟率无显著差异（P>0.05）,但两组卵母细胞成熟率均显著高于A组（P<0.05）;A组卵母细胞卵裂率均显著低于B、C、D组（P<0.05）,B、C、D组间卵母细胞卵裂率无显著差异（P>0.05）;D组囊胚率显著高于其他3组（P<0.05）。结果表明,抽卵法获得卵母细胞效率显著高于割卵法,肝素钠及半胱氨酸对黄牛卵母细胞体外成熟和体外受精都有促进作用,且同时添加两种物质对体外成熟的效果更佳。     

牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究

探讨了人工合成培养液ＣＲ１ａａ和小鼠胎仔成纤维细胞对牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明，牛体外受精卵在ＣＲ１ａａ液中的卵裂率达７６．２％，８细胞胚的比率达４４．８％。小鼠胎仔成纤维细胞能够显著促进牛体外受精的早期囊胚以上胚胎的发育。牛体外受精后第５、６天的早期胚胎分别与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，在受精后第７天发育至囊胚以上的比率分别达１９．８％和２４．６％；受精后第８天，孵化的囊胚比例分别达５．２％和７．５％。实验表明，受精后第５、６天的牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，可显著提高扩张囊胚和孵化囊胚数量。小鼠成纤维细胞对胚胎发育的支持作用取决于胚胎发育阶段