猪圆环病毒2型Cap蛋白体外表达技术研究进展

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原。一般情况下,PCV2感染会导致被感染猪免疫力下降,造成严重的免疫抑制,引起多种病毒或细菌的混合感染或继发感染,给疾病诊断和治疗带来巨大困难。目前,兽医临床上防控PCVAD的最有效手段仍然是疫苗免疫接种,尤其以衣壳蛋白(Capsid,Cap)为靶抗原研制的PCV2基因工程疫苗备受青睐。然而,能够获得大量、可溶性、富有活性的PCV2 Cap蛋白是成功研制该疫苗的关键。综述了近些年来国内外学者利用大肠埃希菌、酵母、病毒活载体和细菌活载体等体外表达系统表达PCV2 Cap蛋白的研究进展,以期为今后PCV2快速检测技术研究和PCV2基因工程疫苗的研制提供参考。     

嵌合猪圆环病毒的构建

[目的]为了构建猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的嵌合病毒,并为PCV2疫苗研究奠定基础.[方法]以PCV1基因组为骨架,将其衣壳基因替换为PCV2衣壳基因,来构建嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)DNA克隆,将PCV1-2 DNA克隆转染PK-15细胞以获得拯救病毒PCV1-2,并测定PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性.[结果]酶切和序列测定显示成功构建出PCV1-2 DNA克隆;免疫荧光试验和PCR检测显示成功获得拯救病毒PCV1-2,其效价达到1060 TCIDs0/mL以上;一步生长曲线显示PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性与其亲本病毒近似.[结论]成功构建了1种具有较高体外增殖能力的嵌合猪圆环病毒.     

猪圆环病毒2型Rep基因真核表达载体的构建和免疫原性分析

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列设计并合成1对特异性引物,进行PCR扩增,从PCV2突变株中扩增出PCV2 Rep基因,对PCR扩增产物清洁后进行双酶切,连接到pEGFP-C1载体上,转化到大肠杆菌DHSα感受态细胞中,经PCR筛选和测序后鉴定出正确的重组基因,完成真核表达载体的构建。将重组质粒转染到PK15细胞中,收取病毒液抽提DNA,PCR检测到Rep基因,证明转染是成功的。进行间接免疫荧光试验,可以检测Rep基因在PK15细胞中的表达,试验结果很好的验证了Rep基因的免疫原性。这为进一步研究PCV2的生物学活性及PCV2新型疫苗奠定了坚实的基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

紧密连接在维持肠道黏膜完整性和免疫系统正常发挥功能中作用重大。【目的】旨在探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染对猪小肠上皮细胞(IPEC)紧密连接的影响。【方法】利用基因克隆获得Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1 (ZO-1)基因的重组质粒并建立荧光定量RT-PCR标准曲线;利用所建立的方法检测PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1mRNA的动态变化。【结果】构建的两种紧密连接蛋白基因的重组质粒荧光定量RT-PCR标准曲线线性关系良好,相关系数均达0.99以上。PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和ZO-1mRNA表达在4、12、24、48、72h均显著下降。【结论】PCV2感染可抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达,破坏细胞间的紧密连接,增加肠道通透性。     

表达PCV2 Cap蛋白重组杆状病毒对小鼠的保护力试验

PCR扩增猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白(Capsid)基因,鉴定后克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastBac-Cap,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经转座作用,蓝白菌落筛选得到含cap基因的重组穿梭载体Bacmid-Cap,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒reBacCap,PCR能够扩增出相应大小的片段,间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使reBac-Cap感染的Sf9昆虫细胞出现特异性绿色荧光,表明reBac-Cap在Sf9细胞中成功表达PCV2-Cap蛋白.动物试验表明该重组病毒对小鼠有一定的保护力.     

猪圆环病毒病的研究进展

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科圆环病毒属成员,是迄今发现最小的动物病毒。PCV有Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)两个基因型。其中PCV1无致病性,而PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体。PCV2主要侵袭猪的免疫系统,干扰和破坏免疫抗体的产生,导致PCV2与其他多种病原混合感染而     

猪圆环病毒2型生物学特性与致病特征研究进展

综合分析猪圆环病毒2型(PCV2)的病原生物学和临床致病特征。PCV2病原生物学研究表明,PCV2在猪的不同生长发育阶段的易感细胞存在差异,可调节单核细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌;PCV2存在2个基因亚型,并在ORF2中存在可区分两型的特异性核苷酸序列,PCV2b型为1486-TcAaacCCCGG,PCV2a型为AcC aacAAAAT;我国PCV2分离株与国外分离株同源性不高,推测PCV2在我国存在的时间也比较长,经过多年的流行,病毒发生了变异。在致病特征研究方面,PCV2与多种病原混合感染导致多系统衰竭、呼吸困难、繁殖障碍并可加重腹泻病毒的毒性。     

一株猪圆环病毒2型的分离与分子鉴定

利用PCR技术初步检测疑似PCV2感染的猪肺脏和淋巴结中的病毒.将样品处理后接种于PK-15细胞.从感染PK-15细胞PCR扩增PCV2基因片段,克隆入pMD18-T载体,并进行序列测定和比较.序列分析结果表明,分离病毒的PCR产物与国内多株PCV2核酸同源性大于98%,说明所分离的病毒为PCV2.     

猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

紧密连接在维持肠道黏膜完整性和免疫系统正常发挥功能中作用重大。【目的】旨在探讨PCV2感染对猪小肠上皮细胞(IPEC)紧密连接的影响。【方法】利用基因克隆获得Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)基因的重组质粒并建立荧光定量RT-PCR标准曲线;利用所建立的方法检测PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1mRNA的动态变化。【结果】构建的两种紧密连接蛋白基因的重组质粒荧光定量RT-PCR标准曲线线性关系良好,相关系数均达0.99以上。PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和ZO-1 mRNA表达在4、12、24、48、72 h均显著下降。【结论】PCV2感染可抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达,破坏细胞间的紧密连接,增加肠道通透性。     

猪圆环病毒2型感染对猪小肠上皮细胞Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1基因mRNA表达的影响

紧密连接在维持肠道黏膜完整性和免疫系统正常发挥功能中作用重大。【目的】旨在探讨PCV2感染对猪小肠上皮细胞(IPEC)紧密连接的影响。【方法】利用基因克隆获得Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)基因的重组质粒并建立荧光定量RT-PCR标准曲线；利用所建立的方法检测PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和闭锁小带蛋白-1mRNA的动态变化。【结果】构建的两种紧密连接蛋白基因的重组质粒荧光定量RT-PCR标准曲线线性关系良好，相关系数均达0.99以上。PCV2感染的IPEC中Claudin-1蛋白和ZO-1 mRNA表达在4、12、24、48、72 h均显著下降。【结论】PCV2感染可抑制猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白相关基因的表达，破坏细胞间的紧密连接，增加肠道通透性。     

猪圆环病毒2型陕西株的分离鉴定

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的序列,设计2对PCR引物,对疑似PCV2感染猪的血液、肺脏和淋巴结等病料进行套式PCR扩增检测,并对PCR检测为PCV2阳性的病料进行PCV2分离与鉴定。结果显示,PCV2在PK-15细胞上生长良好,但增殖较慢且不产生细胞病变;在第12代细胞培养物中用间接免疫荧光试验(IFA)和PCR扩增反应均能检测到PCV2,且特异性很强。表明试验分离的病毒为PCV2。     

PCV2与PPV共感染猪PBMCs对其白细胞介素转录时相影响

为分析PCV2与PPV体外共感染对猪外周血单个核细胞(PBMC)对其白细胞介素mRNA转录水平的影响,探讨PCV2与PPV体外混合感染的致病机制。运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PCV2和PPV感染PBMC后PCV2,PPV的病毒核酸含量及IL-1β,IL-6,IL-8,IL-12p35,IL-12p40,IL-13,IL-17,IL-18等的转录时相变化。结果表明,PCV2,PPV能够感染PBMC细胞,PCV2/PPV共感染中PCV2,PPV的含量分别在24 h显著最高(P0.01);PCV2,PPV单独感染和PCV2与PPV共感染PBMC后引起IL-1β,IL-6,IL-8,IL-17转录水平上升,IL12p35,IL-12p40,IL-18转录水平明显受到抑制。由PCV2,PPV共感染而引起的免疫反应和免疫抑制比单独感染更明显。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO-HTb,转化BL21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。     

猪圆环病毒2型培养方法的研究

利用有限稀释法从含猪圆环病毒2型(PCV2)的PK15细胞中克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15-A8细胞株,初步研究了该克隆株中PCV2增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光试验结果表明,将该克隆株在方瓶中静置培养连续传代40代后病毒滴度最高可达10~(7.5)TCID_(50)/mL,用生物反应器培养病毒滴度最高可达10~(8.0)TCID_(50)/mL以上。利用常规方瓶培养细胞方法,在37℃培养96h,收获得到猪圆环病毒2型病毒液。本研究结果为进一步开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗奠定了基础。     

表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

【目的】以伪狂犬病病毒为载体，构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒，并研究其生物学特性。【方法】将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中，构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒，然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。【结果】利用检测PCV2 ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+，同时用Southern blotting证实外源基因PCV2 ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting结果显示重组病毒中PCV2 ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明，重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当，且重组病毒对小鼠无致病性，免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。【结论】重组伪狂犬病毒构建成功，且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。     

猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建及其免疫效果

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因疫苗,并对其免疫效果和安全性进行研究。【方法】将PCV2ORF2基因从pMD-ORF2*质粒(包含PCV2 SCH A株ORF2基因)酶切回收,插入到真核表达载体pcD-NA-3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA-ORF2,对该质粒进行酶切和PCR鉴定。将pcDNA-ORF2转染IBRS-2细胞,进行Western blotting检测。将构建好的pcDNA-ORF2制成核酸疫苗,按100μg/只腿部肌肉注射免疫Balb/c小白鼠,同时设pcDNA-3.1(+),PCV2全毒和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第14天和56天采血,用ELISA法检测抗体;于首免后第56天,采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)对小鼠的细胞免疫进行检测。取首免后56 d小鼠的心肝、脾、肺、肾和脑等实质器官,采用PCR方法检测pcDNA-ORF2核酸疫苗的安全性。【结果】Western blotting结果显示,pcDNA-ORF2构建成功,并在哺乳动物细胞中获得表达。pcDNA-ORF2核酸疫苗能诱导小鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫应答。PCV2ORF2基因未整合到小鼠染色体上。【结论】pcDNA-ORF2可诱导小鼠产生免疫反应,其对小鼠是安全的。     

猪圆环病毒3型与宿主相互作用机制研究进展

猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3, PCV3)从2015年发现至今已在全世界多个国家和地区的养猪业被检出，是重要的新发猪病病原体。目前有关PCV3致病机制的研究有限，大部分集中于PCV3的流行病学调查、基因组演化分析和检测方法建立。猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)与宿主之间关系紧密且复杂，二者的相互作用决定宿主细胞的命运和病毒的传播与存活。部分学者通过瞬转表达系统、临床分离和反向遗传学技术从病毒组分或全病毒水平对PCV3与宿主相互作用展开研究。本文系统阐述宿主细胞对PCV3感染的应答机制、PCV3-宿主蛋白的相互作用，以及PCV3生命周期的研究结果，将有助于进一步了解PCV3及其致病机制。     

PK-15细胞在微载体悬浮放大培养及PCV2增殖工艺研究

为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5 g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×105cells/m L的初始接种密度及培养至第2天进行换液操作工艺可以获得最佳的PK-15细胞生长效能。胰酶消化转移将PK-15细胞从1 L反应器放大至3 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,培养3 d细胞密度可达34.3×105cells/m L。采用感染复数为0.1的接毒比例,细胞接毒后在微载体上传至第3代收获毒液可获得最高的PCV2增殖效价107.25TCID50/m L。为PCV2疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。