表达鹅细小病毒VP3基因的重组杆状病毒的构建

参照Zadori等发表的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)B株基因序列,设计合成了一对引物,扩增GPV VP3基因.将该基因克隆于转移质粒载体pFastBac/HBM-TOPO中,获得重组转移质粒pFastBac/HBM-TOPO-VP3,并将其转化入DH10Bac细胞中,得到重组穿梭质粒Bacmid-VP3,再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBacmid-VP3,经PCR鉴定证实目的基因正确插入到杆状病毒基因组中.     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

A群猪轮状病毒VP6结构蛋白在杆状病毒系统中的表达及鉴定

为在杆状病毒表达系统中表达和纯化A群猪轮状病毒(PoRVA)VP6结构蛋白,在PoRVA VP6基因5'端融合添加组氨酸标签(6×His)后,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB中,得到重组转移载体pFastBac-VP6,并将其转化至DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆状病毒杆粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒rBac-PoRVA-VP6,经SDS-PAGE和western blot鉴定结果显示,表达的PoRVA重组VP6蛋白约45 ku,并且能够被PoRVA阳性血清识别。上述结果表明,经杆状病毒表达系统表达的重组VP6蛋白具有良好的反应原性,为建立PoRVA抗体检测技术奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备

为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒,本试验通过RT-PCR技术扩增出鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株JL株的VP2全长基因,并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建含有IBDV VP2基因的重组供体质粒pFast-VP2,转化DH10Bac E.coli感受态细胞中,经蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-VP2,将重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞,提取DNA,经PCR电泳分析,得到1条与预期大小相符的特异性条带;间接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-blotting分析,在大约53 000处出现1条特异性的蛋白条带;电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀,均可见重组VP2蛋白自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明IBDV VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,并自组装成了IBDV病毒样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对AsiaⅠ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白功能及建立AsiaⅠ型FMDV血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法从pGEM-T-Easy-AsiaⅠ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-VP1再转入DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-VP 1,然后转染Sf9昆虫细胞。PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1,SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白。将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出AsiaⅠ型口蹄疫病毒阳性血清。AsiaⅠ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为AsiaⅠ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因在昆虫细胞/杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统对Asia Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VPl基因在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白功能及建立Asia Ⅰ型FMDV血清学诊断方法奠定基础.采用PCR方法从pGEM-T-Easy-Asia Ⅰ型VP1质粒中扩增VP1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFast-BaeHTA-VPl再转入DH10Bae感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Baemid-VPl,然后转染Sf9昆虫细胞.PCR鉴定证实VP1基因正确地插入到Bacmid中,成功构建了杆状病毒重组质粒Baemid-VP1,SDS-PAGE和West-ern-blotting检测结果表明,VP1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约26.5 ku的VP1蛋白.将可溶性表达的融合蛋白用Ni-NTA亲和层析方法进行纯化,通过ELISA分析,能特异性地检测出Asia Ⅰ型口蹄疫病毒阳性血清.Asia Ⅰ型FMDV VP1基因在杆状病毒表达系统中的成功表达为Asia Ⅰ型FMDV VP1蛋白的抗原性及血清学抗体水平检测研究奠定了基础.     

猫泛白细胞减少症病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

根据猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)GT-2株VP2蛋白全长基因序列设计1对特异性引物,以GT-2毒株为模板,PCR扩增VP2基因片段(去除终止密码子);与转座载体pFastBacI连接,构建重组质粒pFastBac-VP2,并进行测序鉴定;鉴定正确后,转化到含有辅助质粒的大肠杆菌DH10Bac中,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中;经蓝白斑筛选后获得重组Bacmid-VP2,转染Sf9昆虫细胞。电镜负染结果表明:重组Bacmid-VP2在昆虫细胞中包装,形成了大量的杆状病毒粒子;VP2蛋白得到表达并形成了FPV病毒样颗粒。直接免疫荧光试验证明,FPV VP2蛋白在重组杆状病毒中获得了表达。利用双抗体夹心ELISA法检测病毒样颗粒的表达量,表明目的基因在昆虫细胞中获得了较高水平的表达。将表达蛋白作抗原免疫小鼠,经抗体测定证明表达的重组蛋白能诱导机体产生特异性免疫应答。     

A型塞内卡病毒VP1结构蛋白在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定

目前在昆虫杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector system,BEVS）中表达A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）结构蛋白VP1尚未见报道。本研究将VP1基因通过限制性酶切位点插入杆状病毒载体pFastBac I,然后将鉴定正确的重组载体转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,对鉴定正确的菌落提取质粒。将质粒转染Sf9昆虫细胞,待有明显细胞病变后收获重组杆状病毒rBac-I-VP1,并进行病毒滴度测定。随后通过蛋白免疫印记（Western Blot）和间接免疫荧光（IFA）鉴定VP1蛋白表达情况。结果显示,重组杆状病毒rBac-I-VP1滴度为6.8×105 pfu/mL;Western Blot可检测到相对分子质量约27 kDa的表达产物,且其能够被SVA兔阳性多克隆血清识别;IFA试验显示,VP1蛋白能够在Sf9细胞内表达。结果表明,本研究利用BEVS表达的SVA VP1蛋白具有良好的免疫反应性,为其后期功能研究及SVA诊断试剂研制提供了技术基础。     

猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

为开发猪O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLPs)基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列(登录号:JN998085),设计针对VP1、VP2、VP3和VP4 4个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP3、VP1和VP4、VP2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒(pFastBacDual)的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP2 2个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜(EM)进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP4 4个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1～VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25～30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。     

鹅细小病毒SS/10株VP3蛋白的原核表达及鉴定

根据GenBank收录的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计并合成了一对VP3基因扩增引物。采用PCR技术对SS/10株的VP3基因进行扩增,将目的基因和原核表达载体PET-32a分别经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,获得重组质粒PET-32a-VP3,并将其转化表达菌BL21(DE3)pLysS。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了72ku左右的融合蛋白,大部分以包涵体的形式存在于菌体中。Wesern blot结果表明,该蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

鹅细小病毒VP3与禽分枝杆菌副结核亚种hsp65融合基因真核表达载体的构建及鉴定

为了构建鹅细小病毒(GPV)的VP3与禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的hsp65融合基因重组真核表达载体,试验克隆了VP3和hsp65基因,并将二者先后插入真核表达载体pVAX1中,构建重组质粒pVAXl-VP3和pVAXl-hsp65-VP3.酶切和PCR鉴定表明表达载体构建正确,用脂质体将二者分别转染入Vero细胞中,间接免疫荧光检测其在细胞中的表达.结果显示,转染细胞表面可见绿色荧光,说明hsp65、VP3基因表达成功.试验为GPV的DNA疫苗研制及hsp65分子佐剂在动物医学中的应用奠定基础.     

鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。     

番鸭细小病毒强毒株(MDPV-Q)VP_2基因的序列分析

应用PCR技术扩增了MDPV_Q株的VP2 蛋白基因片段。将扩增后的VP2 基因重组到pMD18_T质粒载体上 ,并对插入片段进行序列测定。将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列分别与MDPV、GPV进行了同源性比较及分析。结果表明 ,我国分离的MDPV_Q株其VP2 基因序列与国外分离株具有很高的同源性。而与GPV的同源性较低。     

应用PCR技术检测鹅细小病毒

根据鹅细小病毒GPVH1株结构蛋白VP1与VP3编码基因非重叠核苷酸序列设计了一对引物GPR1 /GPR2 ,用这对引物对感染器官内的GPR和接种鹅胚增殖的GPV进行PCR扩增 ,其结果引物GRP1 /GPR2能特异性地扩增GPVVP1 VP3区段核苷酸序列 ,扩增出与设计核苷酸片段大小相符的 0 6kb的序列 ,而对照的鹅副粘病毒cDNA及鸭瘟病毒 (DPR)DNA对照组均出现阴性结果。     

鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2-VP3）基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列设计了一对引物,对国内两株鹅细小病毒毒株(GPV　CC株)和(GPV　FS株)主要结构蛋白（VP2-VP3）基因进行PCR扩增，并克隆到pCR3.1T载体，分别获得正向、反向连接重组质粒pVPC1、pVPC2和pVPF1、pVPF2，经酶切鉴定筛选出阳性克隆质粒并进行核苷酸序列分析比较，序列分析结果表明：GPV　CC株和GPV　FS株VP2-VP3的核苷酸大小分别为1　764　bp和1　763　bp,其中GPV　CC株与A株同源性达到98.9%；GPV　FS株缺失一个碱基,与A株同源性为93.5%,与GPV　CC株同源性为93%。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与幽门螺杆菌铁蛋白基因融合PCR扩增及其真核表达载体的构建

为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌（Hp）铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。     

番鸭源鹅细小病毒ZQ株VP2基因的克隆和序列分析

根据国内外已发表的鹅细小病毒(GPV)B株和GD株基因序列,应用DNA Star分子生物学软件设计一对引物,应用PCR技术扩增GPV ZQ株的结构蛋白基因VP2全基因片段。将扩增得到的VP2全基因克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。结果表明ZQ株基因大小为1 764 bp,编码587个氨基酸,其基因序列与GPV参考毒株推导的氨基酸序列同源性在89.1%~99.3%之间,差异较大;与番鸭细小病毒(MDPV)参考毒株相比同源性在92.0%~92.5%之间,超过与部分GPV毒株的同源性,推测可能与该毒株来源于番鸭而不是鹅有关,另外也在基因水平上解释了GPV与MDPV在血清学上存在交叉反应的部分原因。     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,用纯化的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV) VP3蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体(mAb),经间接ELISA方法筛选和有限稀释法进行3次亚克隆后获得一株抗鹅细小病毒VP3蛋白杂交瘤细胞株(4E5).经鉴定,该mAb为IgGl亚型,轻链为κ链.Western blot试验结果表...