鹅GnRH基因CDS区克隆、序列分析及原核表达

本研究旨在了解鹅GnRH基因的CDS区序列及其蛋白表达情况,研究鹅GnRH蛋白的生理功能,为进一步阐明GnRH蛋白影响鹅繁殖性能的调控机制提供理论基础。采用RT-PCR方法从溆浦鹅下丘脑扩增获得GnRH基因的CDS区序列,将测序正确的DNA序列定向克隆到pET28a(+),构建表达载体pET28a-GnRH,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western blot分析。结果显示:获得的溆浦鹅GnRH基因CDS区部分序列,含有270个核苷酸,编码前体蛋白中的90个氨基酸;溆浦鹅GnRH基因CDS区在大肠杆菌中得到高效表达,GnRH基因CDS区的目的蛋白为9 900,最终测得菌体湿重为0.6g/L,纯化后得到的蛋白为20~30mg/L;清晰检测到GnRH基因表达的蛋白特异带,试验获得的抗体对原核表达的GnRH蛋白具有特异性反应;鹅GnRH基因在动物进化中高度保守,研究得到的鹅GnRH前体蛋白可为进一步研究GnRH基因的生物功能以及其对鹅就巢、产蛋等繁殖性状的影响奠定基础。     

奶牛乳腺炎源性大肠杆菌csgC基因的克隆及载体构建

根据GenBank上发表的curli菌毛csgC基因序列设计了1对特异性引物.从患乳腺炎的奶牛乳汁中分离出致病性大肠杆菌,经生物学鉴定后,提取全基因组DNA为模板,PCR扩增出csgC基因,连入pMD18-T克隆载体,测序,结果表明,扩增片段含有333个核苷酸,编码111个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的大肠杆菌W3110的全基因组DNA中的csgC基因序列最相近,氨基酸序列同源性为99.7%.该基因与原核表达载体pET32a+相连,转入BL21(DE3)感受态细胞.挑选阳性菌落经PCR鉴定和酶切鉴定后表明成功构建原核表达载体pET32a+/csgC.     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列(登录号:U03756)设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达。     

单增李斯特菌lmo0331基因的克隆、序列分析及原核表达

试验旨在对单增李斯特菌临床分离株（LM90SB2）的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956 bp,ORF全长为1 857 bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88 ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

单增李斯特菌lmo0331基因的克隆、序列分析及原核表达

试验旨在对单增李斯特菌临床分离株(LM90SB2)的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956bp,ORF全长为1 857bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。     

牛支原体P33蛋白的原核表达及鉴定

为了实现牛支原体P33蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验在不改变P33蛋白氨基酸序列的情况下,根据GenBank发表的P33基因序列(登录号为AIA33909.1)设计并合成特异性引物,利用PCR法扩增P33基因,进行双酶切并将基因片段克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)/P33,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后进行原核表达,再利用His-tag镍柱纯化P33重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:成功扩增得到牛支原体P33基因,其核苷酸序列长度为710 bp,重组菌株在温度为30℃、以0.5 mmol/L IPTG诱导12小时时,P33蛋白表达量最高;经His-tag镍柱纯化后P33蛋白在33 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中表达牛支原体P33重组蛋白。     

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470 bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3 mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。     

单增李斯特菌lmo2193基因克隆与原核表达

为了对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2193基因进行克隆及其原核表达,采用PCR方法扩增lmo2193基因,连接pMD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。将目的基因克隆至原核表达质粒p ET32a中,构建重组质粒pET32a-2193,并转化大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达后,利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果显示:扩增得到的lmo2193基因序列长度为1 077 bp,与预期一致;该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE检测和Western blot鉴定分析表明该产物为1个60 ku左右的融合重组蛋白。本研究成功克隆lmo2193基因,并获得大量表达,为进一步研究lmo2193基因功能奠定基础。     

弓形虫棒状蛋白ROP54编码基因的生物信息学分析及原核表达

为了能够获得刚地弓形虫RH株棒状蛋白ROP54的重组蛋白，本研究进行了弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因的生物信息分析及原核表达。运用RT-PCR方法扩增刚地弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因序列，并连接至pMD-18-T载体，构建出克隆质粒pMD-ROP54后，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，测序后对基因序列进行生物信息分析。将pMD-ROP54及pET-28a经双酶切及连接，构建出原核表达质粒pET-ROP54,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况，Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果显示，成功扩增出长度约1 440 bp的ROP54蛋白编码基因序列。生物信息学分析显示，测序结果与刚地弓形虫M49株比对同源性为99%。预测ROP54蛋白氨基酸序列1至26个氨基酸为信号肽，亲/疏水性最小值是-2.978,最大值是2.700。成功构建了原核表达质粒pET-ROP54,IPTG诱导后经，SDS-PAGE结果可见约52.94 kDa大小的蛋白表达，且能够被犬抗弓形虫血清识别，具有良好的反应原性。本研究成功...     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

猪Sar1b基因的分子克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

PADRE-TGFβ1融合蛋白的原核表达及鉴定

构建PADRE-TGFβ1原核表达质粒,并对其进行诱导表达和反应原性分析.对PADRE、联接序列(Linker)及TGFβ1的基因序列进行密码子优化,采用全基因合成的方法人工合成全长PADRE-Linker-TGFβ1序列,合成产物克隆至pET-28a(+)质粒.将构建好的质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受...     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

京海黄鸡肌细胞生成素基因的克隆和生物信息学分析

本试验根据GenBank中公布的原鸡肌细胞生成素（myogenin,MyoG）基因序列设计1对引物,采用RT-PCR方法,从京海黄鸡肌肉组织中克隆MyoG基因的编码区序列,并使用多种生物软件和在线工具对目的序列进行生物信息学分析,分析MyoG 基因与其他物种的同源性、蛋白质的理化性质、蛋白质序列的跨膜区、亚细胞定位、亲水性、潜在的磷酸化位点、保守结构域及该基因编码蛋白的二级结构和三级结构。最终获得了包括编码区在内的长754 bp的MyoG基因序列,生物信息学分析显示,京海黄鸡MyoG基因的保守性较低,与GenBank中原鸡、火鸡、鹌鹑、马、人、野猪、牛、山羊、大鼠、绵羊的同源性分别为99.7％、94.4％、92.0％、70.0％、70.0％、73.3％、69.0％、67.9％、67.8％、73.5％;氨基酸分析发现,MyoG蛋白为水溶性蛋白,分子质量为25854 u,理论等电点为5.46,不属于跨膜蛋白;亚细胞定位显示,大部分蛋白位于细胞质内,不属于分泌蛋白;预测含有6个潜在的磷酸化位点,1段碱性序列,1段HLH序列,1段低复杂度序列;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示MyoG蛋白的结构域呈螺旋状。     

猪口蹄疫病毒多抗原表位的原核表达与纯化

利用限制性酶切从重组质粒pShuttle-CMV-VP中得到猪O型口蹄疫病毒VP1(21-60)-(141-160)-(200-213)位氨基酸的基因。将此多抗原表位基因克隆至原核高效表达载体pET43.1 a(+),在E.coliBL21中用IPTG诱导表达了含有猪口蹄疫病毒多抗原表位的融合蛋白,并用镍柱亲和层析法获得了纯化蛋白。W estern-b lot结果表明融合蛋白可被猪O型口蹄疫病毒标准阳性血清所识别,从而为进一步研究FMDV多表位抗原的免疫特性和诊断方法奠定了基础。     

小尾寒羊CIB1基因全长cDNA克隆及原核表达

本研究旨在克隆小尾寒羊钙粘和蛋白1(Calcium and integrin binding protein 1,CIB1)基因cDNA全长,并在原核载体中表达.参照已发表的CIB1基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,采用RT-PCR法,从小尾寒羊睾丸组织中扩增获得CIB1基因全长cDNA.将其克隆到pMD19-T载体,并进行测序分析.将该基因编码区重组于融合表达质粒pET32a中,构建了重组原核表达载体(pET32a-CIB1).将其转化到BL21(DE3)pLysS宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.结果表明,克隆的CIB1基因cDNA与GenBank上登录的牛、猪、猕猴、人、小鼠、大鼠、黑猩猩等动物该基因序列的同源性达90%以上,编码氨基酸的同源性在93%以上,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为576 bp.实现了高效特异性融合表达,表达产物的分子质量约为38 ku.本研究结果为进一步研究CIB1蛋白功能打下良好的基础.     

牛皮蝇Hypodermin A基因在大肠杆菌中的表达

从牛皮蝇Ⅱ期幼虫中提取总RNA,进行RT-PCR扩增牛皮蝇Hypodermin A基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达栽体pET30-HA,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达,得到表达量达到全菌蛋白35%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达产物大部分以包涵体形式存在.Western-blot检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin A,具有较好的免疫活性.     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达

根据 Gen Bank中致病性嗜水气单胞菌气溶素 (Aer)基因的序列设计引物 ,以国内嗜水气单胞菌分离株为模板 ,扩增出 Aer基因的全长序列。经 T载体克隆和序列测定 ,证实克隆了国内分离株的不含信号肽的 Aer全长基因。将该基因以正确的读码框架与表达载体 p ET2 8b连接 ,经 IPTG诱导、SDS- PAGE检测 ,外源基因获得高效表达。诱导 4 h的培养物中 ,融合蛋白的表达占菌体总蛋白含量的 4 8.5 7%。 Western-印迹结果显示 ,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地识别嗜水气单胞菌产生的天然毒素 ,而且天然毒素制备的抗体也能识别纯化的重组毒素