牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列(登录号:AF130119.1)设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高(61.78%),无规则卷曲次之(20.78%)。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

牛支原体新疆分离株P48基因克隆及分子特征分析

本研究旨在分析牛支原体P48基因的序列特性、蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株P48基因序列（GenBank登录号：CP002188.1）设计特异性引物,运用Overlap-PCR扩增获得P48基因全长,其目的片段连接到pMD19-T载体上并进行测序,利用生物信息学方法分析和预测其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、结构功能（信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构和三级结构）。结果显示,分离株P48基因序列为1 407 bp,与Mb PG45国际标准株的同源性为100%,聚类于一支;P48基因编码467个氨基酸残基,组成一个无跨膜、稳定的亲水性蛋白;P48蛋白存在信号肽,有44个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（41.76%）,无规则卷曲次之（37.69%）。功能预测显示,在信号转导、胁迫应答、受体等方面该蛋白存在较高概率。本研究成功克隆了分离株P48基因片段,其编码的蛋白是一个稳定可溶、亲水性蛋白,为分析分离株P48基因的特性和功能提供了一定的理论基础和科学依据。     

荷斯坦牛免疫抗病相关Nramp1基因生物信息学分析

为研究牛的抗病能力,探究荷斯坦牛Nramp1基因所编码蛋白的结构与功能,本研究采用生物信息学分析的方法对荷斯坦牛Nramp1基因编码蛋白质的理化性质、疏水性/亲水性、信号肽跨膜区、跨膜结构域、N-糖基化位点和磷酸化位点、蛋白质二级结构、三级结构及蛋白质互作进行分析和预测.结果表明,荷斯坦牛Nramp1基因所编码蛋白全长...     

牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCT_η基因的克隆与生物信息学分析

对牛卵形巴贝斯虫延边株的伴侣素CCTη基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对CCTη基因进行了同源性、系统进化树、编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析。结果显示,克隆的CCTη基因由1 008个核苷酸组成,其中编码335个氨基酸。与GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列(AB367928.1)同源性100%。CCTη基因编码蛋白等电点为7.32,不存在信号肽结构、跨膜区及糖基化位点。疏水性最大值3.38,最小值-3.79。本研究从CCTη基因方面近一步证实了该分离株的分子分类。     

延边牛PPARγ基因的克隆及生物信息学分析

研究旨在克隆和分析延边牛过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因,并探讨其在延边牛不同组织中的表达规律。参考GenBank数据库中牛PPARγ的序列（登录号：NM_181024.2）设计引物,以18月龄延边牛为试验对象,利用RT-PCR克隆得到延边牛PPARγ基因,利用NCBI中的BLAST程序与其他物种进行相似性分析并构建系统进化树;用生物信息学软件分析其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构等;用实时荧光定量PCR检测延边牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、皮下脂肪、肌肉8个组织中PPARγ基因的相对表达水平。结果显示,延边牛PPARγ基因CDS区序列为1 620 bp,相似性比对和系统进化树结果显示,与黄牛的亲缘关系最近,相似性为99.9%,与鸡的亲缘关系最远,相似性为82.1%;该基因编码505个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,为亲水性蛋白,主要分布在细胞核和细胞质中;延边牛PPARγ蛋白二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,存在53个潜在的磷酸化位点,24个O-糖基化位点;实时荧光定量PCR结果显示,延边牛PPARγ基因在脾脏、皮下脂肪、肝脏中表达量显著高于心脏（P<0.05）,肺脏、肾脏、肌肉和小肠中表达量显著低于心脏（P<0.05）。以上试验结果可为进一步研究PPARγ基因的功能提供借鉴。     

奶牛DQA2基因序列特征分析

为了获得荷斯坦牛DQA2基因序列并研究其序列特征及编码蛋白的结构和功能,本研究采用DNA混合池扩增后直接测序的方法,通过DNAstar软件和在线服务器预测中国荷斯坦牛DQA2基因CDS区编码蛋白的理化性质、疏水性/亲水性、糖基化位点、信号肽、跨膜结构、二级结构以及三级结构。结果表明,中国荷斯坦牛DQA2基因CDS区长度为765bp,编码254个氨基酸,蛋白结构预测是一种混合型的可溶性蛋白质,具有4个潜在的N-糖基化位点,分别为Asn31、Asn96、Asn260、Asn369;在第1~23位氨基酸之间存在信号肽;存在1个典型的跨膜螺旋区,氨基酸序号为217-239。本研究结果为进一步研究荷斯坦牛的抗病育种提供了理论基础。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA12的生物信息学分析

为分析并预测弓形虫致密颗粒蛋白GRA12基因编码蛋白的结构、功能以及其作为疫苗候选抗原的可能性,本研究从Gen Bank数据库获取GRA12基因序列,通过在线蛋白分析专家系统(Expasy)并结合GENERUNR、DNAStar、DNAMAN等生物信息学分析软件对GRA12序列的编码区进行分析、对该基因编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构域、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等信息预测。结果表明:该基因全长1 311 bp,编码436个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为47.8 ku,无信号肽,有6个跨膜区,14个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点、3个酪氨酸磷酸化位点、18个O-糖基化位点、3个乙酰化蛋白附着位点、1个酪氨酸硫酸化位点、1个潜在的N-糖基化位点、1个棕榈酰化位点,15个潜在的抗原表位。研究结果分析说明GRA12有潜力成为弓形虫疫苗候选抗原。     

郏县红牛POLB基因克隆及生物信息学分析

【目的】 克隆郏县红牛DNA聚合酶β（DNA polymerase beta,POLB）基因,并对其进行生物信息学分析。【方法】 以郏县红牛肌肉组织cDNA为模板,通过PCR方法克隆POLB基因完整CDS区序列;利用在线软件进行遗传距离分析并构建系统进化树,分析POLB蛋白的理化性质、疏水性、磷酸化位点、跨膜结构、信号肽、二级结构、三级结构和互作蛋白。【结果】 郏县红牛POLB基因CDS区序列全长1 008 bp,编码335个氨基酸。系统进化树分析表明,郏县红牛POLB基因氨基酸序列与绵羊等反刍动物的亲缘关系最近,与其他哺乳类动物和禽类次之,与斑马鱼（鱼类）最远。郏县红牛POLB蛋白分子质量为38.26 ku,理论等电点（pI）为9.10,半衰期为30 h,不稳定系数为31.06,总平均亲水系数为－0.659,属于稳定的亲水性蛋白;磷酸化位点预测分析发现,郏县红牛POLB蛋白包含17个丝氨酸磷酸化位点、12个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;跨膜区和信号肽预测结果显示,郏县红牛POLB蛋白不属于跨膜蛋白和分泌型蛋白;二级结构和三级结构预测发现,其主要包含α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲4种结构;在线软件预测结果表明,POLB蛋白与XRCC1、FEN1、PARP1和LIG3等为互作蛋白。【结论】 本研究成功克隆了郏县红牛POLB基因CDS序列,其与绵羊亲缘关系最近;POLB蛋白为无跨膜结构、无信号肽的亲水性蛋白,与XRCC1蛋白互作程度最高,结果可为进一步探究POLB基因生物学功能提供参考。     

延边牛PLIN2基因CDS区克隆、生物信息学分析及其表达规律研究

本研究旨在克隆延边牛脂肪分化相关蛋白PLIN2基因完整CDS区,通过生物信息学分析PLIN2基因CDS区序列和蛋白质基本特性,探讨其在延边牛不同组织及前体脂肪细胞成脂过程中的表达规律。选取18月龄去势的延边牛为研究对象,利用RT-PCR和基因克隆获得延边牛PLIN2基因,与其他物种进行同源性比对及系统进化树构建,利用生物信息学方法预测PLIN2编码蛋白质的理化性质、潜在磷酸化位点及糖基化位点、二硫键分析、信号肽、亚细胞定位、蛋白高级结构,利用实时荧光定量PCR检测PLIN2基因在延边牛不同组织中的表达水平。结果显示,延边牛PLIN2基因CDS长1 353 bp,编码450个氨基酸;同源性比对发现延边牛PLIN2基因与黄牛、水牛、绵羊、山羊、野猪、人、小鼠和野鸡的同源性分别为100%、98.7%、96.7%、97.1%、85.5%、86.3%、47.3%和49.1%;系统进化树表明,延边牛与黄牛、水牛的亲缘关系最近,与野鸡的亲缘关系最远。PLIN2蛋白为不稳定蛋白,具有一定亲水性,存在61个潜在的磷酸化位点、16个O-糖基化潜在位点、12个N-糖基化潜在位点,存在2个二硫键,不存在信号肽,主要分布于细胞核中,细胞质和线粒体中有少量分布。PLIN2蛋白高级结构预测该蛋白是由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角组成,为混合型蛋白,通过无规则卷曲连接,以α-螺旋为主。实时荧光定量PCR结果显示,PLIN2基因在延边牛小肠组织中表达量最高,其次为背最长肌和肾脏组织。本研究结果可为进一步研究PLIN2基因的功能提供借鉴。     

山羊痘病毒069蛋白的表达与结构分析

为了分析山羊痘病毒THx株069基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本试验应用PCR技术对069基因进行扩增,并构建原核表达载体,经测序鉴定后用IPTG诱导表达其蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。用DNAStar及Mega软件对GenBank登录的24个该基因参考序列进行同源性比对并作遗传进化树分析;同时采用生物信息学分析方法对069蛋白信号肽、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、抗原决定簇、亲水性、二级及三级空间结构进行预测。结果表明:GTPV-069号基因全长为573 bp,与参考株GTPV-pellor相似度高达97.19%,经同源性比对与遗传进化树分析发现,山羊痘病毒THx株069基因序列与绵羊痘亲缘关系较近,在同一分支上,与疙瘩皮肤病和其他山羊痘亲缘关系较远。SDS-PAGE鉴定表明069蛋白大量表达于上清中,条带清晰。Western blot结果证明069蛋白与His标签确实进行了融合表达;生物信息学分析发现GTPV-069蛋白无信号肽、含有跨膜结构,跨膜区在29～51 aa之间,为典型的膜蛋白。069蛋白含有8个抗原决定簇、1个糖基化位点和14个磷酸化位点。二级结构分析显示,069蛋白中α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占43.46%,25.65%,23.04%和7.85%,三级结构预测发现069蛋白以α螺旋为主。本试验为后期探究羊痘病毒其他部分生物学功能以及新型羊痘疫苗的研制提供了依据。     

Genomic, protein and antigenic variability of mycoplasma bovis

Restriction endonuclease analysis (REA) with three enzymes SmaI, PstI, BamHI- was used to identify 13 different genomic groups among 37 Mycoplasma bovis strains. One genomic group was comprised of 14 strains. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) patterns for one strain chosen from each genomic group and an international reference strain PG45 were all similar. Antigenic variability in M. bovis species was investigated by immunoblotting, using serum from a calf that had been naturally infected with M. bovis and three M. bovis-specific monoclonal antibodies — mAbs N₂, I₂ and 5D7. Twenty M. Bovis field strains were tested, comprising one from each genomic group, six from the same genomic group and the reference strain. Antigenic profiles obtained with calf serum differed markedly one from the other, the heterogeneity being equally great among the strains belonging to the same genomic group as those coming from different groups. A stable antigen common to 164 out of 168 strains was detected by mAb N₂, whilst with mAbs I₂ and 5D7, two different membrane antigenic systems were demonstrated that were strikingly variable. These variations in expression occurred not only from one strain to another, but also within the same lineage of clones from a single cell.     

牛源多杀性巴氏杆菌Oma87基因的分子特征、抗原性及遗传进化分析

为研究牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）Oma87基因的分子特征及同源性，本研究对荚膜血清A型（capsular serotype A，Pm8）Oma87基因进行扩增、克隆和测序，利用在线软件对其进行分子特征、抗原性及遗传进化分析。结果显示，Oma87基因全长为2 376 bp，编码791个氨基酸；氨基酸序列分析发现，该蛋白为酸性的亲水性蛋白，稳定性高，具有信号肽结构但不存在跨膜区域；二、三级结构分析发现，该蛋白为无规则卷曲及多段延伸链所形成的"N"字型三维立体结构。遗传进化分析显示，新疆分离株Pm8 Oma87基因与其他不同地域的牛源A型Pm和部分猪源A型Pm的同源性较近，与其他型Pm的同源性较远；通过VaxiJen软件分析发现，Oma87蛋白的保护性抗原的总体预测值为0.5478，高于正常阈值0.4，证明Oma87蛋白可作为免疫原性蛋白，为进一步研究Oma87蛋白奠定了理论基础。     

犊牛支原体肺炎继发牛A型多杀性巴氏杆菌感染的诊治

某奶牛场犊牛相继发生肺炎和关节炎,为确诊该牛场犊牛群发病的原因并提出防控方案,本试验剖检新生犊牛并采集病料,分别开展牛支原体及其他病原菌的分离培养、PCR鉴定及药敏分析;进行牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测;制作犊牛肺脏组织病理切片并进行观察和评估。从犊牛肺脏组织分离到牛支原体和牛A型多杀性巴氏杆菌;牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病毒检测均为阴性;肺脏组织病理切片可见肺泡结构破坏、出血及大量炎性细胞浸润;药敏试验结果显示,牛支原体和牛A型多杀性巴氏杆菌分别对泰乐菌素和头孢唑啉敏感,但对青霉素、庆大霉素、林可霉素和氨苄西林均呈现耐药。该犊牛群确诊为牛支原体肺炎继发牛A型多杀性巴氏杆菌感染,采用泰乐菌素联合头孢唑啉肌肉注射,配合对症治疗和规范管理,有效控制了该场犊牛疾病。     

抗丝状支原体丝状亚种单克隆抗体的制备及初步应用

旨在制备抗丝状支原体丝状亚种(Mmm)的特异性单克隆抗体(MAb),为牛传染性胸膜肺炎(CBPP)病原诊断的免疫学方法提供特异性抗体。本研究利用生物信息学技术分析了Mmm国内分离株Ben-1不同传代株的全基因组序列,选取M0071蛋白作为研究对象。将原核表达的可溶性重组蛋白M0071(rM0071)作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过有限稀释法和间接ELISA方法筛选得到能稳定分泌抗rM0071蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进一步制备单抗腹水并纯化,利用Western blot方法对该单抗进行特异性鉴定,同时测定其抗体效价和抗体亚类。随后利用间接免疫荧光试验(IFA)评价该单抗对细胞感染Mmm的检测能力。结果表明成功获得1株单克隆细胞株3C4A1,将其分泌抗体命名为MAb 3C4A1。特异性结果表明,MAb 3C4A1能与Mmm的分离株和标准株发生特异性反应,而不与山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、牛鼻支原体、无乳支原体、牛支原体、leachii支原体和牛A型巴氏杆菌等发生反应。抗体亚类鉴定MAb 3C4A1属于IgG1亚类、轻链为κ链。经间接ELISA测定其抗体效价为1∶256 000。IFA试验结果表明,MAb 3C4A1仅与感染EBL细胞的Mmm发生绿色荧光反应,而与牛鼻支原体、无乳支原体、牛支原体感染的细胞不发生荧光反应,特异性良好。本研究制备的MAb 3C4A1具有良好的特异性和免疫反应性,可作为CBPP病原免疫学诊断的工具,为进一步研制CBPP病原鉴别诊断试剂盒提供了基础材料。     

拟南芥高亲和性K+载体蛋白基因cDNA克隆及其序列特征分析

以NaCl胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料,用RNA提取试剂盒抽提总RNA,通过RT-PCR技术和DNA序列测定分析,证实获得了拟南芥高亲和性K⁺载体蛋白基因(AtHKT1)的cDNA序列。该cDNA全长1521 bp,包括506个氨基酸和1个终止密码子序列,且与原序列(accession number AF237672)同源性为99.34%,但与其他科植物HKT1基因同源性较低,注册该基因到GenBank中,注册号为AY685182。利用生物信息学相关软件分析预测AtHKT1基因蛋白质功能和结构,结果发现,该蛋白分子量为57.45 kD,理论等电点为9.33;氨基酸序列中第1～40个氨基酸属信号肽序列;第152～500个氨基酸属Trk H阳离子转运体蛋白保守结构域,并存在蛋白激酶C,酪氨酸蛋白激酶,依赖cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化,糖基化和豆蔻酰化等功能位点;该基因编码的蛋白有10个跨膜结构,N末端、C末端及中部等多个跨膜区具疏水性,符合载体类运输蛋白特点。表明本研究获得了拟南芥AtHKT1基因。     

Prokaryotic Expression of NOX2 of Mycoplasma bovis and Its Adherence Characterization

To explore the biological function of NADH oxidase NOX2 from Mycoplasma bovis (Mb), according to the nox2 gene sequence of Mb strain Hubei (GenBank.CP002513.1), the primers were designed and the nox2 gene of Mb strain Lintao was amplified by PCR. Based on sequencing and gene optimization, the prokaryotic expression vector pET-nox2 was constructed, and was expressed in Escherichia coli Rosetta (DE3). Subsequently, the analysis of the enzymatic activity and the immunogenicity of recombinant proteins rMbNOX2 were completed. And then the subcellular localization of NOX2, complement-dependent bactericidal activity of anti-rMbNOX2 serum, and as well as inhibition effect of anti-rMbNOX2 serum to Mb adhering to host cells was determined. The results showed that the CDS sequence of the nox2 gene of Mb Lintao strain was 1 350 bp, and showed 99.93% homology with nox2 gene of all Mb except Mb JF4278 strain in GenBank. The result of SDS-PAGE displayed the optimized nox2 was successfully expressed in E. coli. The recombinant protein rMbNOX2 was about 67 ku. Enzyme activity analysis showed that the purified rMbNOX2 had good enzymatic activity. The results of ELISA and Western blot showed that the rMbNOX2 has excellent immunogenicity, and the Mb NOX2 distribute both in the cell membrane and cytoplasm, but it's more distributed in the cytoplasm. Complement-dependent mycoplasmacidal assay and adherence inhibition assay confirmed anti-rMbNOX2 serum has distinct complement-dependent mycoplasmacidal activity and can also effectively inhibit the adherence of Mb to host cells. The results of this study lay a foundation for further study on the biological function of Mb NOX2.     

牛支原体NOX2的原核表达及黏附特性

旨在探究牛支原体（Mycoplasma bovis,Mb）NADH氧化酶NOX2的生物学功能,本研究参照GenBank中Mb湖北分离株（Mb Hubei-1 strain）nox2基因序列设计引物,应用PCR扩增获得Mb临洮分离株的nox2基因,在测序及序列优化的基础上,构建原核表达载体pET-nox2,并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中诱导表达,进而对表达产物rMbNOX2的酶促活性、免疫原性,NOX2在Mb内的分布,rMbNOX2抗血清的补体介导体外杀菌活性和对Mb黏附宿主细胞的抑制活性进行了分析。结果表明,Mb临洮株nox2基因全长1 350 bp,与GenBank中已知序列的Mb nox2基因序列比较,除Mb JF4278株相似性为97.93%外,其余均为99.93%。SDS-PAGE结果显示,优化的nox2基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白rMbNOX2相对分子质量约为67 ku,且具有良好的酶促活性;ELISA与Western blot结果显示,rMbNOX2具有良好的免疫原性,且Mb NOX2在细胞浆中的分布多于细胞膜;补体介导的体外杀菌试验及黏附抑制试验证实,rMbNOX2抗血清具有明显的补体介导杀支原体活性,并可有效抑制Mb对宿主细胞的黏附。本研究为深入探讨Mb NOX2生物学功能奠定了基础。