共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒的构建

为构建表达禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的重组疱疹病毒(HVT),本研究将AIV A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)的HA基因克隆于真核表达质粒中,构建了转移载体pUAB-gpt-HA。通过同源重组及霉酚酸筛选技术,将HA基因表达盒插入到HVT US10基因区,构建了一株表达H5亚型AIV HA基因的重组病毒HVT(rHVT-US10-HA)。经PCR、间接免疫荧光、western blot及红细胞凝集试验鉴定,重组病毒能稳定表达具有生物学活性的HA蛋白。rHVT-US10-HA的构建为禽流感基因工程病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定

参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。     

表达H5亚型禽流感同义(Consensus)HA蛋白的重组质粒构建及体外表达

为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因并克隆于真核表达载体pCAGGS中构建重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24 h、48 h后分别进行表达蛋白的western blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面;westernblot鉴定结果表明,Cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应分子量约为70 ku。该重组质粒的构建将为进一步Cons-HA5核酸免疫对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护免疫效力研究奠定基础。     

H5亚型AIV HA基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

应用DNAStar软件,参照GenBank中注册的AIV H5亚型毒株HA基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H5亚型AIV的HA基因,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点将H5 HA基因插入转移质粒载体pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFastBacHTa-H5HA并将其转化DH10Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H5HA,再将其转染昆虫细胞High Five,PCR鉴定证实该基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,经SDS-PAGE和Western blotting检测,HA基因在High Five细胞中得到了表达,表达产物大小约为67 ku,而且具有特异的免疫反应性.     

禽流感病毒H7亚型血凝素基因的原核表达及鉴定

参考已发表的禽流感病毒(AIV)H7亚型血凝素(HA)基因序列设计引物，经RT-PCR扩增了AIV-H7亚型的HA1基因片段，再将该片段定向插入到原核表达载体pGEX-4T-2中，转化大肠埃希氏菌。重组表达栽体经酶切和测序鉴定后，用IPTG诱导表达。用Western-blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明，融合表达蛋白能与AIV H7N1、H7N2、H7N7和H1N1亚型标准抗血清反应，而与H5N1、H9N2等其他13个亚型的抗血清无交叉反应。     

携带AIV HA基因鸭肠炎病毒转移载体的构建

为了获得携带禽流感病毒(AIV)HA基因鸭肠炎病毒转移载体,试验采用基因工程方法构建了带有CMV启动子、多克隆位点(MCS)及牛生长因子转录终止信号和加poly(A)信号(BGHpA)等真核表达元件的载体pET-3.1,将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入pET-3.1,再将携带真核表达元件的HA基因插入鸭肠炎病毒通用...     

H9亚型禽流感病毒血凝素特异性单因子血清制备

为制备特异性的H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清,本研究分别将6株不同亚群的H9亚型AIV的血凝素(HA)基因以鸡偏嗜的密码子进行优化,经全基因合成插入高效真核表达载体pCAGGS中,构建的真核重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,间接免疫荧光试验结果表明,重组质粒中的HA目的基因获得表达.将重组质粒以200μg/只的剂量免疫1月龄SPF鸡,6周后采血分离血清.交叉微量血凝抑制试验结果表明,血凝抑制效价可达8 long2～12 log2,灵敏度高,与其他AIV亚型抗原无交叉反应,型特异性强.     

禽流感病毒H5HA、H7HA基因共表达核酸疫苗质粒的构建及其在体外的表达

为了获得既能对 H5亚型又能对 H7亚型 AIV攻击产生保护的核酸疫苗 ,设计构建了含有双顺反子的真核表达载体 ,用限制性内切酶从 PCIH7HA载体上切得 AIV H7HA基因的c DNA,此 c DNA含有 CMV启动子和 Poly(A)终止序列 ,使用 DNA 连接酶引入载体PCIH5HA中 ,最后获得双顺反子真核表达载体PCI-H5HA-H7HA,其中 H5HA和 H7HA基因都带有自己的 CMV启动子和 Poly(A)终止序列。选用 2 93 -T真核表达细胞系 ,用脂质体转染法导入细胞进行瞬时表达 ,转染后 48h用荧光标记的兔抗鸡 Ig G进行间接免疫荧光试验。结果表明双顺反子真核表达载体构建正确 ,且在真核表达细胞系中 H5HA和 H7HA基因都能获得表达 ,且 H5HA 基因的表达效果优于H7HA。这为进一步的动物免疫试验和疫苗效价检测试验奠定了基础     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

木聚糖酶基因的分子生物学与基因工程

广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称 ,主要包括三类 :( 1 )内切 - β -1 ,4-木聚糖酶 ( 1 ,4- β -Ｄ -木聚糖木聚糖水解酶 ,ＥＣ 3,2 ,1 ,8) ,优先在不同位点上作用于木聚糖和长链木寡糖 ,从 β - 1 ,4-木聚糖主链的内部切割木糖苷链 ,从而使木聚糖降解为木寡糖 ,其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖 ,也有少量的木糖和阿拉伯糖。 ( 2 )外切 - β -ｌ,4-木聚糖酶 ( 1 ,4- β -Ｄ -木聚糖木聚糖水解酶 ,ＥＣ 3,2 ,1 ,92 ) ,作用于木聚糖和木寡糖的非还原端 ,产物为木糖。 ( 3) β -木糖苷酶 ( 1 ,4- β -Ｄ …     

抗冻基因及其在基因工程中的应用研究进展

低温是限制植物分布与生长的重要因素,低温伤害是一种严重的自然灾害,全球每年因此造成农作物的损失高达数千亿美元。本文综述了抗寒基因研究中一些已分离和鉴定出的低温诱导表达基因,对抗冻基因的功能特性和作用机制进行了全面的回顾,总结了抗冻基因工程的研究方向,对典型抗冻基因的表达效果进行了比较分析,并提出此领域尚存在的一些问题及发展前景。     

猪产仔数性状主效基因及其候选基因的研究进展

产仔数性状属于低遗传力数量性状,通过常规选育所获得的进展甚微,许多学者在寻找控制该性状的基因和遗传标记方面做了大量研究,并取得了显著成效。本文综述了猪产仔性状主效基因和候选基因的研究情况及其展望。     

轮状病毒VP7基因与LTB基因融合表达及其免疫原性

根据GenBank已发表的牛轮状病毒VP7基因核苷酸序列(DQ195152),成功克隆了牛轮状病毒野毒株CHLY VP7基因的3个主要抗原簇并在大肠杆菌中进行了高效表达,然后与LTB(大肠杆菌不耐热性肠毒素)基因融合后再一次成功表达,表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,得到了高纯度的目的蛋白。动物试验表明,该抗原蛋白可在小鼠体内诱导产生一定水平的抗体。     

锌与基因表达

锌是动植物体组成的必需成分,也是动植物体生长发育过程中必需的微量元素。在动物的生长发育过程中,锌参与不同的细胞进程,包括催化作用、基因表达和细胞凋亡和氧化应激的抑制剂犤1犦。例如,锌至少是60～80种酶的组成部分犤2犦,它在酶中主要是提供结构或催化作用。碳酸酐酶的活     

蓝狐细小病毒VP2基因与NS1基因的克隆与序列分析

根据GenBank上发表的犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)核酸序列,分别设计扩增VP2基因与NS1基因的特异性引物,采用PCR技术扩增蓝狐细小病毒(Blue fox parvovirus,BF-PV)泰安分离株(BFPV-TA)的VP2基因和NS1基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析.结果显示,BFPV-TA VP2基因含有1个ORF,全长1 755 bp,共编码584个氨基酸,第219位氨基酸发生I→V(219I→V)改变,300G→P,411E→A;BFPV→TA NS1基因含有1个ORF,全长2 007 bp,共编码668个氨基酸,8个氨基酸残基发生改变,43R→H,135H→Y,172K→R,179A→E,350D→N,4091→V,574I→V,616D→V.BFPV-TA VP2基因与CPV和FPV参照株的同源性在98.4%～99.4%,BFPV-TA NS1基因与CPV和FPV参照株的同源性为98.6%～99.1%.VP2基因系统发生分析,BFPV-TA与FPV的亲源关系较为密切,但NS1基因系统发生分析,BFPV-TA成单独的分支.     

大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析

为检测大肠杆菌在某抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系.分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测定.四环素诱导株产生重耐药,氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药;四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致.四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因突变,诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致.     

传染性造血器官坏死病病毒G基因全长cDNA克隆及重组表达研究

本研究旨在克隆G基因全长并与其他传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)株进行分析,为IHNV的预防检测提供依据。通过提取IHNV-G蛋白RNA并进行扩增,将其克隆到p MD-18T并与p Chlamy-4载体相连,重组到莱茵衣藻中并提取总蛋白,结果可得:扩增片段长度为1 500 bp,经SDS-PAGE电泳得到一条大约为58 k Da的蛋白条带,Westen Blot分析结果显示,重组莱茵衣藻所表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合;并且以重组表达的G蛋白为抗原,鼠抗IHNV血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗,再次进行Westen Blot检验,其结果显示,经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应,并在58 k Da处出现了一条明显的特异性条带,具有良好的反应原性。表明重组莱茵衣藻表达系统构建成功。     

猪流感病毒H3N2亚型济南株HA、NA、NP基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H3N2亚型HA、NA、NP基因序列,分别设计扩增HA、NA、NP基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒(SIV)H3N2济南株(SW/SD/JT/07(H3N2))HA、NA、NP基因,分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T栽体,进行测序分析.结果显示,SW/SD/JT/07(H3N2)HA基因长度约为1701 bp,编码566个氨基酸,与参考毒株的同源性为65.2%～81.8%;HA0切割位点序列为PENQTR↓G,属非高致病性毒株;SW/SD/JT/07(H3N2)HA蛋白有7个糖基化位点,由于碱基突变缺少了1个糖基化位点,表明其抗原性及其生物学特性发生变化.SW/SD/JT/07(H3N2)与所有参考毒株HA蛋白上的受体结合位点的氨基酸很保守,即98、134、136、138、226位分别为Tyr、Gly、Ser、Ala、Asn.SW/SD/JT/07(H3N2)NA基因长为1413 bp.编码470个氨基酸,与参考毒株的同源性为65.1%～91.8%,NA基因系统发生分析表明SW/SD/JT/07(H3N2)与禽流感病毒H3N2亚型亲缘关系最近.SW/SD/JT/07NA(H3N2)NA蛋白与参考毒株的颈区63、64、65位置均无氨基酸缺失现象,可推测其对病毒的复制能力不会有很大影响.SW/SD/JT/07(H3N2)NP基因长为1565 bp,编码498个氨基酸.与参考毒株的同源性为79.8%～87.8%,NP基因系统发生树分析结果表明,2002年、2004年暴发的西班牙流感同源性较高,亲缘关系较近,而与中国内地广东株同源性小,亲缘关系较远.     

猪流感病毒H1N1亚型济南株HA、NA、NP基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H1N1亚型HA、NA、NP基因序列,分别设计扩增HA、NA、NP基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒(SIV)H1N1济南株(SW/SD/JT/07)HA、NA、NP基因,分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果显示,SW/SD/JT/07(H1N1)HA基因长为1 701bp,编码566个氨基酸;HA蛋白切割位点为IPSIQSR↓G,属于非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,其中有6个在HA1蛋白上,有2个在HA2蛋白上,与个别参考毒株糖基化位点个数不同;HA蛋白上的受体结合位点与多数参考毒株一致。SW/SD/JT/07(H1N1)NA基因长为1 410bp,编码469个氨基酸;NA基因颈部未发现氨基酸缺失现象;NA蛋白的头部有5个可能的抗原位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别由5个区段组成,在340、346、366位分别为P、I、N,其余参考毒株在相应位置的氨基酸分别为S、V、S;NA蛋白共有8个糖基化位点,与个别参考毒株的糖基化个数不同。SW/SD/JT/07(H1N1)NP基因长为1 565bp,编码498个氨基酸,根据HA、NA、NP基...