猪流感病毒H1N1亚型济南株HA、NA、NP基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H1N1亚型HA、NA、NP基因序列,分别设计扩增HA、NA、NP基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒(SIV)H1N1济南株(SW/SD/JT/07)HA、NA、NP基因,分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果显示,SW/SD/JT/07(H1N1)HA基因长为1 701bp,编码566个氨基酸;HA蛋白切割位点为IPSIQSR↓G,属于非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,其中有6个在HA1蛋白上,有2个在HA2蛋白上,与个别参考毒株糖基化位点个数不同;HA蛋白上的受体结合位点与多数参考毒株一致。SW/SD/JT/07(H1N1)NA基因长为1 410bp,编码469个氨基酸;NA基因颈部未发现氨基酸缺失现象;NA蛋白的头部有5个可能的抗原位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别由5个区段组成,在340、346、366位分别为P、I、N,其余参考毒株在相应位置的氨基酸分别为S、V、S;NA蛋白共有8个糖基化位点,与个别参考毒株的糖基化个数不同。SW/SD/JT/07(H1N1)NP基因长为1 565bp,编码498个氨基酸,根据HA、NA、NP基...     

猪流感病毒H9N2亚型济南株HA、NA基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H9N2亚型HA基因与NA基因序列,分别设计扩增HA基因与NA基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒H9N2济南株(SW/SD/JT/07)HA基因和NA基因,分别将RT-PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果表明,SW/SD/JT/07 HA基因长度为1701bp,编码566个氨基酸,HA0切割位点序列为R-S-S-R-G,属非高致病性毒株;HA蛋白有8个糖基化位点,与参考毒株糖基化位点数一致;HA蛋白有5个受体结合位点,其中在190位氨基酸与其余参考毒株存在差异。SW/SD/JT/07 NA基因长度为1413bp,编码470个氨基酸,NA蛋白基质结合部与参考毒株一致,高度保守;NA蛋白有5个抗原位点,在325位为D其余参考毒株均为N,SW/SD/JT/07与DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99在398位为E,其余参考毒株为D或N;SW/SD/JT/07 NA蛋白与CK/SH/F/98,DC/HB/W1/04,CK/GS/2/99,SW/GD/WXL/04,SW/SD/W4/03,SW/YN/Simao2/07一样在茎区63,64,65位发生氨基酸缺失。SW/SD/JT/07 HA基因与参考毒株的同源性82.5%～98.6%,NA基因与参考毒株的同源性82.2%～99.1%。SW/SD/JT/07 HA基因与NA基因系统发生树分析表明,SW/SD/JT/07与AIV H9N2亚型亲缘关系密切。     

H1N2亚型猪流感病毒HA、NP、NA、M和NS基因的克隆与序列分析

对3株H1N2亚型猪流感病毒(SIV):Sw/GX/17/05、Sw/HN/1/05和Sw/GX/13/06的血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)基因进行克隆和序列分析.结果显示:3株分离毒株HA、NP、NA、M和NS基因之间核苷酸同源性分别为91.3%～98.0%、98.4%～98.8%、97.4%～98.3%、98.8%～99.8%和98.1%～98.4%.遗传进化分析显示:分离毒株与美国分离的三源基因重排H1N2 SIV具有较近的亲缘关系;在HA、NP、M和NS基因进化树中,3株分离毒株均位于古典H1N1亚型SIV群,在NA基因进化树中,3株分离毒株则位于人流感病毒群.HA和NA基因推导氮基酸序列分别与代表毒株古典H1N1 SIV A/swine/Maryland/23239/1991(H1N1)和人H3N2流感病毒A/Buenos Aires/4459/96(H3N2)比较分析显示:HA(95.4%～96.1%)和NA(96.6%～97.2%)具有较高的氨基酸同源性;糖基化位点、抗原位点和受体结合位点(HA)处氨基酸存在一定的差异,这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究.     

两株H9N2亚型猪流感病毒全基因进化分析

用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型猪流感病毒河南株(Swine/Henar/Y1/09)和H9N2亚型猪流感病毒上海株(Swine/Shanghai/Y1/09)的8个基因片段,进行测序分析.结果表明,这两株猪流感病毒HA基因长度均为1701 bp,编码566个氨基酸,HA切割位点序列均为R-S-S-R-G,属非高致病性毒株;这两个毒株的HA蛋白均有8个潜在的糖基化住点.两个分离株的NA基因长度为1401 bp,编码467个氨基酸,这两个毒株均在茎区63、64、65位发生氨基酸缺失.两株猪流感病毒HA基因的同源性为96.6％,NA基因的同源性为98.6％.两株毒株的8个基因片段系统发生树分析表明它们均为重组体,与2008年上海地区健康鸡群中分离的H9N2亚型毒株(Ck/Shanghai/Y 1/2008)8个基因片段均分别属于同一个基因群.     

鸭源流感病毒分离株表面蛋白基因的克隆及序列分析

从湖南分离得到一株H5N1亚型禽流感病毒(AIV),首先设计合成两对HA和NA基因特异性引物,采用两步法RT-PCR,对鸭流感病毒株 A/Duck/HunanWugang/2/2004(H5N1)(简称DK/HNWG/2/04)的表面蛋白基因进行序列测定,并与国内外已经发表的H5N1亚型毒株表面蛋白基因进行序列分析和比较.结果表明,HA和NA基因全长分别约为1.7 kb和1.4 kb,分离株与14个参考毒株HA基因的同源性为95.9%～98.0%,NA基因的同源性为87.0%～98.4%.根据HA基因核苷酸序列推导HA裂解位点氨基酸,发现分离株的裂解位点包含多个碱性氨基酸,符合高致病性禽流感的特征.     

H3N2亚型猪流感病毒重庆株的分离、鉴定、基因组测定及序列分析

从猪流感疑似病例中分离鉴定猪流感病毒,并对病毒进行全基因组测序及其序列的分析。采用鼻棉拭子法从猪流感疑似病猪的鼻中收集病样,制成病毒悬液,经SPF鸡胚增殖培养和纯化。采用红细胞凝集、血凝抑制和神经氨酸酶抑制试验进行病毒亚型的判定,并作电镜观察。运用RT-PCR法扩增病毒的8个基因片段,分别克隆到pMD18-T载体,进行全基因组测序及序列分析。结果表明,获得1株猪流感病毒,经血凝、血凝抑制和神经氨酸酶抑制试验,判定为H3N2亚型,命名为A/swine/Chongqing/CQ/3/2011(H3N2),简称SIV CQ3。基因组序列比较分析显示,SIV CQ3 8个节段与不同时间的猪流感广东分离株(H3N2亚型)相应基因的核苷酸相似性最高,可能来源于H3N2亚型SIV。然而NP、HA和NA基因编码氨基酸序列与参考毒株A/New York/392/2004(H3N2)的相似性比较低,分别达95%、89%和90%;而血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-E-K-Q-T-R↓G,与参考毒株的一致,不具有高致病分子特征。此外,HA和NA的糖基化位点、受体结合位点处氨基酸存在一定程度的差异。最后,系统进化树分析显示NP、HA基因位于SIV群,与A/swine/Guangdong/2006/(H3N2)处于同一分支;而NA基因与禽流感(A/duck/Ontario/2000/AJ697881)和猪流感位于同一个进化单元,表明这株H3N2亚型流感病毒在不断的发生演变。     

禽流感病毒A／Turkey／Canada／63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒（AIV）A／Turkey／Canada／63毒株，提取病毒基因组总RNA，应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段，并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明，该毒株的HA基因全长为1745bp，含有完整的阅读框架，编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp，编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示，该毒株HA基因属于H6亚型，NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析，表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80．5％～87．3％，氨基酸的同源性为88．0％～93．1％；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86．0％～93．5％，氨基酸的同源性为90．6％～96．3％。     

4株H3N2亚型猪源流感病毒HA基因的序列测定与特性分析

从广东省不同猪场分离到4株H3N2亚型猪源流感病毒A/Swine/Guangdong/01/2004、A/Swine/Guang-dong/02/2004、A/Swine/Guangdong/03/2004、A/Swine/Guangdong/04/2004.根据GenBank公布的H3N2亚型猪源流感病毒的HA基因序列,设计1对引物,运用RT-PCR方法扩增四株病毒的HA基因,并进行测序和分析.同源性分析和遗传进化分析表明本实验的4株H3N2亚型SIV HA基因核苷酸序列同源性为99.8%～99.9%,在遗传进化树中均位于同一分支上.与参考毒株的比较分析表明,4个毒株与WHO推荐的2001-2004年北半球H3N2亚型流感疫苗株A/Moscow/10/99 HA基因的核苷酸序列同源性最高为99.4%～99.5%,4个毒株与A/Moscow/10/99 HA基因在遗传进化树中位于同一个小分支上.氨基酸序列比较发现,4个毒株HA基因裂解位点处的氨基酸序列均为PEKQTR↓G,4个毒株推导的氨基酸序列中均有11个糖基化位点,4个毒株HA蛋白226位受体结合位点(RBS)处氨基酸均为异亮氨酸(Ⅰ).4个毒株HA基因的氨基酸序列、受体结合位点以及糖基化位点均与A/Moscow/10/99相应的氨基酸序列一致.本试验的4株H3N2亚型猪源流感病毒的HA基因属于以A/Moscow/10/99为代表的近代类人H3N2亚型流感病毒,在一定程度上揭示了广东省H3N2亚型猪流感病毒HA基因进化与流行情况.     

猪流感病毒H1N1广东分离株HA基因的克隆与进化分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR,从广东不同地区猪场分离鉴定出8株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)。用流感病毒血凝素(HA)基因通用引物扩增了8株病毒的血凝素(HA)基因,经克隆测序,HA基因全长1 757 bp,编码566个氨基酸。8个毒株的HA基因推导氨基酸序列分析表明,均含有8个潜在的N糖基化位点,且糖基化位点相同,其HA1、HA2之间切割位点序列为IPSIQSR↓G,从分子水平推论,此8株H1N1 SIV均属于非高致病性毒株。同源性分析表明,此8株病毒的氨基酸序列与经典SIV之间的同源性在92.3%~94.7%之间;与2009年甲型H1N1流感病毒同源性在80.4%~92.4%之间;与欧洲类禽SIV分离株同源性在80.4%~84.1%之间。进化关系表明,该8株SIV与A-swine-Shanghai-3-2005-H1N1同处一分支,与2009年甲型H1N1流感病毒和经典SIV分离株亲缘关系较近,与欧洲类禽SIV分离株亲缘关系较远。     

禽流感病毒H9N2亚型西藏分离株HA和NA基因的克隆与序列分析

为了从分子水平上掌握西藏各地区H9亚型禽流感病毒的遗传进化情况及其与国内外H9亚型禽流感病毒的变异情况和流行规律之间的关系,作者选择了2009年不同时间从西藏部分地市养殖场分离的3株禽流感H9N2亚型毒株,采用RT-PCR技术对其HA和NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,3株西藏分离病毒之间的HA和NA基因变异程度不大,同源性达到98%以上,在遗传进化中均属于欧亚分支中的类Bj/94亚分支,3株西藏分离毒的HA基因与Bj/94的同源性在核苷酸水平为88.7%～88.8%,在氨基酸水平为93.4%～93.6%;NA基因与Bj/94的同源性在核苷酸水平为92.7%～93.0%,在氨基酸水平为93.4%～94.0%;3株西藏分离毒株可能与Bj/94由同一毒株进化而来。由于基因突变使Tb/1毒株的HA基因在313位出现了1个新的糖基化位点,Tb/4毒株的NA基因缺失了146位的糖基化位点;唾液酸吸附位点上有明显的突变;HA的裂解位点附近和NA基因的受体结合位点区域内都有氨基酸突变。HA和NA基因的变异可能与适应高原缺氧、高海拔等特殊气候环境有关。     

抗冻基因及其在基因工程中的应用研究进展

低温是限制植物分布与生长的重要因素,低温伤害是一种严重的自然灾害,全球每年因此造成农作物的损失高达数千亿美元。本文综述了抗寒基因研究中一些已分离和鉴定出的低温诱导表达基因,对抗冻基因的功能特性和作用机制进行了全面的回顾,总结了抗冻基因工程的研究方向,对典型抗冻基因的表达效果进行了比较分析,并提出此领域尚存在的一些问题及发展前景。     

木聚糖酶基因的分子生物学与基因工程

广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称 ,主要包括三类 :( 1 )内切 - β -1 ,4-木聚糖酶 ( 1 ,4- β -Ｄ -木聚糖木聚糖水解酶 ,ＥＣ 3,2 ,1 ,8) ,优先在不同位点上作用于木聚糖和长链木寡糖 ,从 β - 1 ,4-木聚糖主链的内部切割木糖苷链 ,从而使木聚糖降解为木寡糖 ,其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖 ,也有少量的木糖和阿拉伯糖。 ( 2 )外切 - β -ｌ,4-木聚糖酶 ( 1 ,4- β -Ｄ -木聚糖木聚糖水解酶 ,ＥＣ 3,2 ,1 ,92 ) ,作用于木聚糖和木寡糖的非还原端 ,产物为木糖。 ( 3) β -木糖苷酶 ( 1 ,4- β -Ｄ …     

猪产仔数性状主效基因及其候选基因的研究进展

产仔数性状属于低遗传力数量性状,通过常规选育所获得的进展甚微,许多学者在寻找控制该性状的基因和遗传标记方面做了大量研究,并取得了显著成效。本文综述了猪产仔性状主效基因和候选基因的研究情况及其展望。     

轮状病毒VP7基因与LTB基因融合表达及其免疫原性

根据GenBank已发表的牛轮状病毒VP7基因核苷酸序列(DQ195152),成功克隆了牛轮状病毒野毒株CHLY VP7基因的3个主要抗原簇并在大肠杆菌中进行了高效表达,然后与LTB(大肠杆菌不耐热性肠毒素)基因融合后再一次成功表达,表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,得到了高纯度的目的蛋白。动物试验表明,该抗原蛋白可在小鼠体内诱导产生一定水平的抗体。     

锌与基因表达

锌是动植物体组成的必需成分,也是动植物体生长发育过程中必需的微量元素。在动物的生长发育过程中,锌参与不同的细胞进程,包括催化作用、基因表达和细胞凋亡和氧化应激的抑制剂犤1犦。例如,锌至少是60～80种酶的组成部分犤2犦,它在酶中主要是提供结构或催化作用。碳酸酐酶的活     

传染性造血器官坏死病病毒G基因全长cDNA克隆及重组表达研究

本研究旨在克隆G基因全长并与其他传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)株进行分析,为IHNV的预防检测提供依据。通过提取IHNV-G蛋白RNA并进行扩增,将其克隆到p MD-18T并与p Chlamy-4载体相连,重组到莱茵衣藻中并提取总蛋白,结果可得:扩增片段长度为1 500 bp,经SDS-PAGE电泳得到一条大约为58 k Da的蛋白条带,Westen Blot分析结果显示,重组莱茵衣藻所表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合;并且以重组表达的G蛋白为抗原,鼠抗IHNV血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗,再次进行Westen Blot检验,其结果显示,经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应,并在58 k Da处出现了一条明显的特异性条带,具有良好的反应原性。表明重组莱茵衣藻表达系统构建成功。     

蓝狐细小病毒VP2基因与NS1基因的克隆与序列分析

根据GenBank上发表的犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)核酸序列,分别设计扩增VP2基因与NS1基因的特异性引物,采用PCR技术扩增蓝狐细小病毒(Blue fox parvovirus,BF-PV)泰安分离株(BFPV-TA)的VP2基因和NS1基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析.结果显示,BFPV-TA VP2基因含有1个ORF,全长1 755 bp,共编码584个氨基酸,第219位氨基酸发生I→V(219I→V)改变,300G→P,411E→A;BFPV→TA NS1基因含有1个ORF,全长2 007 bp,共编码668个氨基酸,8个氨基酸残基发生改变,43R→H,135H→Y,172K→R,179A→E,350D→N,4091→V,574I→V,616D→V.BFPV-TA VP2基因与CPV和FPV参照株的同源性在98.4%～99.4%,BFPV-TA NS1基因与CPV和FPV参照株的同源性为98.6%～99.1%.VP2基因系统发生分析,BFPV-TA与FPV的亲源关系较为密切,但NS1基因系统发生分析,BFPV-TA成单独的分支.     

大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析

为检测大肠杆菌在某抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系.分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测定.四环素诱导株产生重耐药,氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药;四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致.四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因突变,诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致.     

瑟氏泰勒虫p33基因与牛IL-18基因的串联表达

为研究牛IL-18基因对瑟氏泰勒虫p33疫苗的免疫佐剂效应,根据GenBank上已经发表的p33基因序列和牛IL-18基因序列(IL-18)设计2对特异性引物,以瑟氏泰勒虫基因组DNA和pMD-19-T-IL-18质粒DNA为模板,采用SOE-PCR技术将2个基因连接在一起,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,获得1 416bp的目的基因IL-18-p33,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-1-IL-18-p33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小为79 000的融合蛋白。Western blotting检测结果显示,该蛋白与瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究IL-18对瑟氏泰勒虫p33基因疫苗的免疫佐剂效应奠定了基础。