烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

烟草ERF基因NtRAP2-7的表达载体构建及表达模式分析

为了研究烟草Nt RAP2-7基因在非生物胁迫响应中的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个ERF转录因子基因Nt RAP2-7。并利用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的理化性质、空间结构与系统进化关系。序列分析结果表明,该基因序列全长1 398 bp,共编码465个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为51. 16 ku。该蛋白包含一个由3个β-折叠及1个α-螺旋组成的保守结构,并含有58个磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,该蛋白主要定位于细胞核,并包含单分型的核定位信号序列。进化分析表明,Nt RAP2-7蛋白与林烟草RAP2-7蛋白序列同源性最高,为98%。运用q RT-PCR技术进行了该基因的表达模式分析,组织表达分析发现,Nt RAP2-7基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,但在根中的表达量最高。该基因的表达在低钾、高盐、干旱、ABA、H2O2处理下受到诱导和在低温处理下受到抑制,结果表明,烟草Nt RAP2-7基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。并利用双酶切法成功构建了p BI121-Nt RAP2-7过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。     

烟草磷酸酶基因NtPP2C16的克隆、表达载体构建及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化区域上具有PP2C家族进化中相对保守的11个结构亚区。qRT-PCR研究分析结果表明:该基因的表达显著受ABA和H_2O_2 2种信号分子诱导,并且响应干旱、高盐、低温和低钾胁迫。成功构建NtPP2C16-pBI121过表达载体,为解析NtPP2C16参与烟草非生物逆境胁迫响应提供一定的理论依据。     

大豆GmZAT12基因的克隆和表达分析

锌指蛋白是真核生物中被广泛研究的转录因子,在植物生长发育和逆境应答中发挥重要作用。为了揭示大豆锌指蛋白基因功能,从商豆1201中克隆获得GmZAT12基因的CDS全长序列,并对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。通过烟草表皮注射系统检测GmZAT12蛋白的亚细胞定位情况,采用实时荧光定量(qRT-PCR)技术对GmZAT12基因在大豆不同组织和非生物胁迫中的表达模式进行分析。结果表明,GmZAT12全长516 bp,共编码171个氨基酸,分子质量为19.264 28 ku,理论等电点(pI)为9.02;主要构成元件为无规则卷曲和α螺旋;含有20个磷酸化位点,其中以丝氨酸磷酸化位点为主。序列分析结果表明,GmZAT12蛋白含有2个保守的C2H2锌指结构域;亚细胞定位结果显示,GmZAT12蛋白定位于细胞核。qRT-PCR表达分析结果显示,GmZAT12基因在大豆根、叶片和种子中表达量较高,在花和茎中表达量较低;GmZAT12基因受到高温、低温、NaCl和ABA诱导表达,推测该基因可能参与大豆非生物胁迫应答。     

烟草钾转运体NtKT12的克隆及表达分析

克隆烟草钾转运体基因,预测其结构,并分析其进化关系和功能,为研究烟草钾吸收机制奠定基础。采用RT-PCR方法从烟草品种K326中克隆到了一个钾转运体的同源基因,该序列全长为2 532 bp,蛋白编码844个氨基酸,预测分子量为93.1 k Da,等电点为7.2。同源性分析结果显示,该基因与绒毛烟草钾转运体12、林烟草钾转运体12等具有较高的同源性,故命名为NtKT12。生物信息学分析表明,NtKT12具有12个跨膜区。组织表达分析发现该基因在根中的表达量最高。低钾胁迫试验表明,该基因在处理6,24 h后表达量明显高于对照。研究结果为解析NtKT12在烟草钾营养中的功能奠定一定的理论基础。     

玉米ZmGRAS31基因的克隆及功能研究

GRAS蛋白家族是一类植物特有的转录调控因子,在多种植物中均有报道。为了探究玉米GRAS基因家族在逆境胁迫下的功能,本研究从玉米根中克隆获得ZmGRAS31 (AC:NC_024462),该基因全长1422 bp,编码473个氨基酸。生物信息学分析表明ZmGRAS31蛋白分子量为51,700.38Da,理论等电点为4.73,具有GRAS转录因子家族特有的保守结构域,但不具跨膜结构,亲水性较差。玉米原生质体瞬时表达实验表明ZmGRAS31定位于细胞核内。实时荧光定量PCR(qPCR)分析表明,在低温、脱水、高盐、干旱处理下,ZmGRAS31在玉米幼苗均上调表达;不同浓度NaCl处理过表达ZmGRAS31转基因拟南芥植株,其根长优于野生型,由此推测该基因可能参与玉米非生物胁迫应答。     

烟草NtCYP734A1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是一种参与胁迫响应的甾醇类植物激素,CYP734A1基因是油菜素内酯代谢通路上的关键基因。为探索CYP734A1基因在烟草响应非生物胁迫时发挥的功能,本研究以普通烟草品种K326为材料,克隆CYP734A1基因,通过生物信息学技术分析NtCYP734A1蛋白的理化性质及进化关系,运用实时荧光定量法分析CYP734A1基因在不同组织、不同非生物胁迫处理下的基因表达模式。结果表明,CYP734A1基因全长1 638 bp,编码545个氨基酸;亚细胞定位预测NtCYP734A1蛋白存在于内质网。qRT-PCR分析表明,烟草CYP734A1基因在不同组织均有表达,叶中表达量最高,茎中的表达量最低。非生物胁迫处理下,CYP734A1基因在各组织的表达量显著改变,在干旱、盐和低温胁迫下根的CYP734A1基因表达上调;在干旱、盐、高温和低温共4种胁迫下,叶中CYP734A1基因表达下调。     

普通小麦MYB转录因子Tamyb59的克隆及表达分析

为进一步挖掘小麦逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究小麦逆境胁迫响应机制,从前期转录组结果中筛选出1个编码MYB蛋白的基因,暂命名为Tamyb59,通过PCR技术扩增Tamyb59的全长;利用NCBI和DNAMAN软件进行基因序列比对和保守结构域的分析;利用Expasy和TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、亲水系数分析;采用MEGA 6. 0软件构建系统进化树;构建pMDC83-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。采用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,并利用SAS数据处理软件进行差异显著性分析。结果表明:该基因含有典型的SANT保守结构域,CDS序列全长为522 bp,编码173个氨基酸,编码蛋白分子质量为19. 7 ku,理论等电点为7. 61。基因系统进化分析结果表明,Tamyb59与山羊草、粳稻、玉米等9种植物MYB转录因子有52. 0%～85. 6%的同源性,其中与谷子的MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,Tamyb59基因编码蛋白定位在细胞核。利用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,组织表达特异性分析显示,Tamyb59基因在小麦根中的表达量较高,茎、叶和幼穗中表达量较低; PEG和盐胁迫处理过程中,Tamyb59基因的表达均呈现先上升后下降的趋势,说明Tamyb59基因对不同非生物胁迫有不同的响应。     

大豆中3个Dof转录因子的生物信息学及表达分析

植物Dof转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探明Dof转录因子参与大豆对非生物胁迫的响应,对大豆中3个Dof转录因子(GmDof2.1、GmDof3.1和GmDof4.6)的基因序列进行生物信息学分析。3个Dof基因分别位于不同染色体上,它们所编码的蛋白序列长度为212～305个氨基酸残基,均具有1个保守的Dof结构域。3个Dof蛋白主要定位于细胞核中且含有不同数量的磷酸化位点。启动子序列分析表明,GmDof2.1启动子序列中含有3种与逆境和激素响应相关的元件(ARE、DRE1和MBS),GmDof3.1启动子序列中含有6种与逆境和激素响应相关的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、TGACG-motif、W-box和WUN-motif),GmDof4.6启动子序列中含有7种与逆境和激素响应相关的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、GARE-motif、MBS、TGACG-motif和WUN-motif)。实时荧光定量PCR结果显示,3个Dof基因均可不同程度的响应高盐、干旱、低温和高温胁迫。GmDof2.1和GmDof3.1在大豆根中的表达量最高,GmDof4.6在大豆茎中的表达量最高。由此推测3个Dof转录因子可能在大豆应对非生物胁迫过程中发挥转录调控作用。     

大豆转录因子基因GmDof3的克隆及非生物胁迫诱导表达分析

植物Dof (DNA binding with one finger)转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为了探索大豆Dof转录因子与非生物胁迫的关系,本研究利用RT-PCR技术克隆了一个大豆中Dof转录因子基因GmDof3。GmDof3编码含有483个氨基酸残基的蛋白质,分子量为52.91 kD,等电点为8.11。蛋白结构预测发现,该蛋白含有一个典型Dof结合域,定位于细胞核中且含有大量磷酸化位点。进化分析表明大豆GmDof3蛋白与木豆CcDof3蛋白的同源性最高。顺式作用元件预测结果显示,GmDof3启动子序列中含多种逆境响应元件。实时荧光定量PCR表明,高盐、干旱、低温和高温均可诱导GmDof3的表达。本研究结果可以为大豆Dof转录因子在植物抗逆基因工程中的应用提供理论依据。     

盐生植物小花碱茅外整流K~+通道PtSKOR基因的克隆及RNAi载体构建

为研究盐生植物小花碱茅(Puccinellia tenuiflora)耐盐的分子机制,本研究根据已克隆到的Pt SKOR基因片段,利用RACE技术得到小花碱茅Pt SKOR的3'和5'c DNA序列,拼接后的基因全长为2 353 bp,编码715个氨基酸,系统进化分析显示Pt SKOR编码外整流K+通道。在此基础上,采用酶切连接的方法,构建了Ca MV 35S启动子驱动的含Pt SKOR基因片段反向重复序列的Pt SKOR-RNAi植物表达载体。     

马铃薯StNF-Y核转录因子基因的克隆和生物信息学分析

为了研究马铃薯StNF-Y基因在非生物逆境中的作用与功能,在马铃薯抗青枯病基因型ED13中克隆了1个新的NF-YC转录因子(StNF-Y),并对其进行生物信息学分析,预测其生物学功能。结果表明,StNF-Y基因的全长cDNA为1 132 bp,其开放阅读框为693 bp,编码230个氨基酸,氨基酸分子式为C_(1112)H_(1735)N_(317)O_(339)S_(10),等电点为5.37,含有13个磷酸化位点;StNF-Y蛋白分布在胞质中,无信号肽,属于亲水性蛋白,含有高度保守的结构域,属于BUR6 superfamily家族;二级结构显示,StNF-Y蛋白主要由45.65%的α-螺旋、5.65%的延伸链、45.22%的无规则卷曲和3.48%的β-转角组成。系统进化分析结果显示,马铃薯StNF-Y序列与番茄、辣椒和烟草NF-YC序列亲缘关系较近。此外,StNF-Y在多种植物胁迫中起作用。因此,推测StNF-Y可能参与马铃薯相关胁迫抗性的调节。研究结果可为以后进一步深入研究马铃薯StNF-Y的功能以及对逆境胁迫的抵抗机制提供理论依据。     

香蕉乙醇脱氢酶基因的克隆及其逆境胁迫表达

香蕉乙醇脱氢酶基因的克隆及在逆境胁迫下的表达分析,将为进一步研究ADH在香蕉中的功能奠定基础。本研究从香蕉果实抑制差减文库中获得一条香蕉乙醇脱氢酶基因片段,采用RACE技术获得其全长,命名为MaADH。MaADH的cDNA全长1140 bp,编码379个氨基酸。生物信息学分析该基因编码的蛋白分子量为40.7 kDa,等电点为7.09。保守结构域分析发现,该基因具有MDR保守结构域,包含22个NAD结合位点、11个底物结合位点和4个锌结合位点。系统进化树分析表明,MaADH与拟南芥和甘蓝亲缘关系较近。MaADH在盐胁迫和低温胁迫处理的香蕉苗中上调表达;在干旱胁迫下该基因是先上调表达,随后下调表达;在伤害胁迫下是先下调表达后上调表达,但变化不明显。研究说明,香蕉中的乙醇脱氢酶基因在香蕉适应盐、低温、干旱和伤害等逆境中发挥重要的作用。     

水稻耐旱性基因OsERF65的克隆、表达及转录自激活活性分析

ERF家族转录因子普遍存在于植物中,在植物生长发育、抵抗逆境的过程中发挥着重要作用。本研究从‘珍汕97B’中克隆到一个耐旱相关基因OsERF65,属于ERF转录因子家族的成员。生物信息学分析表明,OsERF65含有一个保守的AP2结构域,与AtERF73等同源蛋白的亲缘关系较近。OsERF65的启动子区域含有多个响应非生物胁迫及激素处理的顺式作用元件,定量PCR结果显示该基因的表达明显受干旱、高盐等非生物胁迫处理的诱导;酵母中转录激活活性结果显示OsERF65具有一定的转录自激活活性;烟草瞬时表达结果表明Os ERF65蛋白定位于细胞核中。本研究为进一步研究OsERF65的生物学功能奠定了一定的基础。     

杨树Ptann3基因克隆与表达特性分析

膜联蛋白(Annexin)是一类Ca2+及磷脂结合蛋白,在非生物逆境胁迫方面发挥重要作用,但木本模式植物杨树膜联蛋白基因的研究还未见报道。本研究通过RT-PCR与RACE相结合的方法从毛果杨(Populus trichocarpa)克隆获得膜联蛋白3 (Ptann3)基因c DNA序列,分析发现编码蛋白质Ptann3与其他植物膜联蛋白高度同源,具有过氧化物酶活性结构域、S3氧化还原反应结构域、GTP结合结构域及钙结合位点。构建原核表达载体p ET-28a-Ptann3,转入大肠杆菌BL21 (DE3)中表达分析,Ptann3蛋白分子量35.6 kD,分析表明Ptann3蛋白具有过氧化物酶与ATPase活性。qPCR分析结果显示,Ptann3基因在根、上部茎、下部茎、叶柄、幼叶和成叶中均有表达,在幼叶中表达量最高,在叶柄和根中表达量次之,成叶和茎中表达量最低。此外,研究发现低温、ABA、PEG6000、H2O2和NaCl胁迫处理可显著影响Ptann3基因的表达,推测杨树Ptann3基因在非生物逆境胁迫中发挥重要作用,研究结果对杨树抗逆遗传改良具有重要意义。     

马铃薯转录因子StTCP13基因的原核表达及盐胁迫功能研究

初探StTCP13基因在盐胁迫方面的功能,为StTCP13在马铃薯非生物逆境响应的功能研究奠定基础。采用同源克隆策略获得StTCP13基因编码区全长,利用生物信息学分析蛋白结构域并构建系统进化树,qRT-PCR技术分析该基因表达模式,双酶切法构建StTCP13-pGEX6P1原核表达载体,利用大肠杆菌BL21表达StTCP13-GST标签融合蛋白,观察转StTCP13大肠杆菌BL21在盐胁迫培养基上的表型。结果显示,从马铃薯品种费乌瑞它中克隆得到了StTCP13基因,成功构建了StTCP13-GST标签融合蛋白的pGEX-6P-1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中诱导表达了目的蛋白。生物信息学分析结果表明,该基因CDS全长669 bp,编码一个由222个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质含有1个保守的TCP结构域,融合蛋白大小约为51 ku。系统进化树结果显示,马铃薯StTCP13与潘那利番茄SpTCP13、甜椒CaTCP13亲缘关系较近。表达分析结果显示,该基因在根中表达量最高,在芽眼中表达量最低,其表达受高盐胁迫诱导。盐胁迫表型分析结果表明,StTCP13能提高大肠杆菌对高盐胁迫的耐受性。综上,说明StTCP13在响应盐胁迫逆境中发挥一定功能。     

银杏GbASR基因的克隆、生物信息学及表达分析

为了明确银杏ASR(ABA-stress-ripening)在应答非生物逆境胁迫中的作用,以便为ASR基因功能、环境胁迫研究提供材料。本研究以银杏(Ginkgo biloba)为材料,利用分子生物学技术对ASR基因进行了克隆,构建pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表达载体,进行亚细胞定位分析。采用序列比对方法分析GbASR蛋白结构域及系统进化;利用qRT-PCR方法进行组织特异性表达及非生物逆境胁迫下的基因表达分析。结果表明,银杏ASR基因编码区全长546 bp,共编码182个氨基酸;蛋白质等电点为5.33,分子量大小为20111.24 Da,为亲水性稳定蛋白;GbASR蛋白含有1个高度保守的ABA/WDS结构域,且与火炬松PtASR蛋白同源性较高;GbASR蛋白定位于细胞核。此外,GbASR基因在银杏幼苗根、茎、叶各组织中均有表达,且在叶部有较高的表达;在高盐、干旱和高温胁迫下,GbASR基因均受诱导,且在不同胁迫处理时间0 h、6 h、24 h和48 h的表达存在显著的差异。以上分析说明GbASR基因参与响应高盐、干旱和高温等非生物胁迫,这为植物的育种及解释ASR基因功能提供依据。     

辣椒抗坏血酸生物合成酶GME基因家族的鉴定和表达分析

GDP-甘露糖-3′,5′-异构酶基因(GME)是抗坏血酸途径中的关键限速酶,该基因可以调节AsA合成。为了解辣椒中GME基因家族功能及在非生物胁迫下的表达情况,通过生物信息学方法对辣椒GME基因家族进行鉴定,并对基因结构、结构域、系统进化关系、基因表达模式和非生物胁迫表达情况进行分析。结果表明,在辣椒中有2个GME家族成员,CaGME1和CaGME2,分别分布在3号和8号染色体上,都有6个外显子;CaGME1和CaGME2蛋白均具有NADB Rossmann家族中高度保守的NADPH结合位点、底物特异性结合位点,均不具有信号肽,为亲水性蛋白,定位在细胞质粒的可能性最高,均不具有跨膜结构,二级结构主要以不规则卷曲和α-螺旋为主;系统进化树分析表明,该基因编码的氨基酸序列与番茄和马铃薯的亲缘关系最近;qRT-PCR分析结果表明,在低温、茉莉酸甲酯和盐胁迫下CaGME1和CaGME2均被诱导上调,在赤霉素下均被诱导下调。综上可知,CaGME1和CaGME2基因在胁迫下不同的表达情况表明其在非生物胁迫中发挥作用,可为辣椒逆境胁迫机制研究提供参考。     

小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C_(1417)H_(2246)N_(394)O_(423)S_5,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。综上,获得了TaAPX基因的编码区序列,分析发现其响应干旱、低温和盐等逆境胁迫,提示该基因可能与小麦抗逆境机制密切相关。