烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的特征分析

β-胡萝卜素羟化酶基因在植物类胡萝卜素的合成代谢过程中起着关键的作用。烟草中的类胡萝卜素是烟叶香气物质的主要前体物之一。本研究克隆了烟草4个β-胡萝卜素羟化酶基因。烟草β-胡萝卜素羟化酶基因与其它作物的BCH基因具有相似的结构,由7个外显子和6个内含子组成。其编码的蛋白包含BCH蛋白的保守结构域,即脂肪酸羟化酶超家族保守域。进化分析表明,烟草Nt BCH蛋白与番茄、枸杞、辣椒等茄科作物的BCH蛋白遗传距离较近。组织特异性表达分析表明,Nt BCH1和Nt BCH2基因主要在叶和花中表达,Nt BCH3和Nt BCH4主要在根和花中表达。从本研究结果推断,可以通过调控Nt BCH1和Nt BCH2基因的表达控制烟叶中类胡萝卜素的含量。     

两个烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆和表达分析

为了研究多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在烟草中的生物学功能,运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到2个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因c DNA和DNA全长序列,分别命名为Nt PGIP1(Gen Bank登录号:KF317203)和Nt PGIP2(Gen Bank登录号:KF317204)。Nt PGIP1基因全长为1 413 bp,编码338个氨基酸;Nt PGIP2基因全长为1 185 bp,编码329个氨基酸;两基因均没有内含子序列,核苷酸序列有50%的一致性,编码的氨基酸序列有54%的一致性。两基因编码蛋白均含有植物PGIP蛋白特有的重复保守序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX。对PGIP基因在烟草不同组织表达量分析发现,两基因在根、茎、叶和芽中均有表达,其中均在茎中表达量最高,其次是根,叶中表达量很低。     

烟草NtNHX1-1基因特征分析

烟草是中国重要的经济作物之一。盐胁迫对烟草生产造成巨大危害,克隆盐胁迫响应基因,为从分子水平抵御盐胁迫提供基因资源。本研究克隆了Na+/H+反向转运蛋白基因。该基因编码的蛋白为膜蛋白,具有12个跨膜区。进化分析表明,Nt NHX1-1与番茄的Sl-NHX1遗传距离最近,相似性为95%,其次为甜辣椒的Ca-NHX2,相似性为94%。组织特性表达分析表明,NtNHX1-1基因在茎中表达最高、其次为叶、花和根。NaCl处理后NtNHX1-1基因的表达明显上调,表明该基因可能在烟草抵抗盐胁迫中发挥重要功能。通过调控NtNHX1-1基因的表达有望获得耐盐胁迫烟草新品系。     

大豆GmZAT12基因的克隆和表达分析

锌指蛋白是真核生物中被广泛研究的转录因子,在植物生长发育和逆境应答中发挥重要作用。为了揭示大豆锌指蛋白基因功能,从商豆1201中克隆获得GmZAT12基因的CDS全长序列,并对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。通过烟草表皮注射系统检测GmZAT12蛋白的亚细胞定位情况,采用实时荧光定量(qRT-PCR)技术对GmZAT12基因在大豆不同组织和非生物胁迫中的表达模式进行分析。结果表明,GmZAT12全长516 bp,共编码171个氨基酸,分子质量为19.264 28 ku,理论等电点(pI)为9.02;主要构成元件为无规则卷曲和α螺旋;含有20个磷酸化位点,其中以丝氨酸磷酸化位点为主。序列分析结果表明,GmZAT12蛋白含有2个保守的C2H2锌指结构域;亚细胞定位结果显示,GmZAT12蛋白定位于细胞核。qRT-PCR表达分析结果显示,GmZAT12基因在大豆根、叶片和种子中表达量较高,在花和茎中表达量较低;GmZAT12基因受到高温、低温、NaCl和ABA诱导表达,推测该基因可能参与大豆非生物胁迫应答。     

水稻LRR-RLK基因LP7的克隆及表达分析

LRR-RLK是类受体蛋白激酶RLK家族中最大的亚家族,在调控植物非生物胁迫等方面具有重要作用。为解析水稻LRR-RLK成员LP7(LOC_Os05g24010)在耐低磷胁迫中的作用,从水稻品种日本晴中克隆了LP7全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列,研究其组织表达模式、亚细胞定位及低磷胁迫下的表达变化。结果表明,LP7基因全长2 832 bp,编码943个氨基酸,LP7蛋白具有典型的LRR-RLK成员特征,LP7蛋白与玉米中的同源蛋白NP_001131018同源性比较高,同源性高达77%。组织表达模式分析表明,LP7基因在根、茎、叶等组织中均表达,在叶中表达量最高。亚细胞定位结果表明,LP7蛋白定位于细胞膜上。实时荧光定量PCR分析表明,LP7基因受低磷胁迫诱导表达,其表达量较正常培养条件下增加15倍。初步推测该基因可能在水稻响应低磷胁迫中具有重要作用。     

烟草K~+通道NtSKOR基因的克隆及表达分析

钾通道是植物吸收和转运K~+的主要蛋白质,SKOR属于Shaker通道外整流家族,在植物低钾胁迫反应中起关键作用。为了研究烟草NtSKOR基因在非生物逆境胁迫中的功能和作用,以普通烟草K326为试验材料,同源克隆一个NtSKOR基因c DNA全长,利用实时荧光定量PCR表征基因表达模式,结合生物信息学分析,对蛋白的理化性质、结构域、磷酸化位点和进化关系等进行初步预测。生物信息学分析表明,该基因全长2 484 bp,编码827个氨基酸残基,预测分子量为94. 75 ku,等电点为6.52。该蛋白最大二级结构元件为α-螺旋,最小为β-转角,含有6个跨膜结构域(S1～S6),具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种不同激酶磷酸化位点。进化分析表明,NtSKOR与美花烟草和绒毛状烟草SKOR蛋白同源性高,分别是99%和96%,故命名为NtSKOR。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中根中表达量最高,花中表达量最低。逆境胁迫试验表明,该基因能快速响应低钾、高盐、干旱、H_2O_2、ABA和4℃等非生物逆境处理。由此推测,NtSKOR在烟草非生物逆境胁迫起着重要调节作用,为今后进一步深入研究NtSKOR功能提供了理论基础。     

中间锦鸡儿CiMYB60基因克隆及表达分析

本研究以中间锦鸡儿作为实验材料,利用PCR技术分别对CiMYB60基因的cDNA与gDNA进行了克隆。测序结果表明:CiMYB60基因的开放阅读框为1 035 bp,编码345个氨基酸,其基因组DNA序列长度为1 485 bp,含有2个内含子和3个外显子。生物信息学分析显示:CiMYB60所编码蛋白的N端包含2个MYB结构域,因此认为其属于典型的R2R3-MYB类蛋白。克隆得到CiMYB60基因的ATG上游序列1 848 bp,分析显示该启动子中包含一些与光反应、组织特异性表达、激素和非生物胁迫相关的响应元件。对CiMYB60基因的表达模式进行分析发现在脱水、NaCl和UV-B处理下其表达量随胁迫处理时间的延长而降低。上述研究结果表明CiMYB60基因可能参与中间锦鸡儿对非生物胁迫等逆境胁迫的响应过程,为进一步研究该基因在非生物胁迫中的功能和表达调控提供了一定的参考。     

烟草磷酸酶基因NtPP2C16的克隆、表达载体构建及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化区域上具有PP2C家族进化中相对保守的11个结构亚区。qRT-PCR研究分析结果表明:该基因的表达显著受ABA和H_2O_2 2种信号分子诱导,并且响应干旱、高盐、低温和低钾胁迫。成功构建NtPP2C16-pBI121过表达载体,为解析NtPP2C16参与烟草非生物逆境胁迫响应提供一定的理论依据。     

辣椒转录因子CaNAC23基因的克隆与表达分析

为分析NAC转录因子在辣椒发育及非生物胁迫中的功能,本研究以‘晋尖椒22’为试验材料,克隆获得CaNAC23基因全长,该基因全长1 899 bp,编码632个氨基酸,预测分子量约为72.54 kD,等电点为6.26,无序化区域有7个。二级结构预测和亚细胞定位预测表明CaNAC23含有一个保守的NAC结构域,定位于细胞核。氨基酸序列比对和进化树分析表明CaNAC23和拟南芥AT3G03200 (NAC045)同源性较高,进化上在同一分支。CaNAC23基因的组织表达特异性和非生物胁迫下的表达模式结果表明:CaNAC23在叶片中表达量最高,其次是根,暗示CaNAC23基因可能参与辣椒叶片或根发育相关。CaNAC23能够被干旱和盐胁迫诱导表达,推测其参与调控辣椒的非生物胁迫调控。本研究结果为研究NAC转录因子在辣椒发育及非生物胁迫应答中的功能提供了参考依据。     

普通小麦MYB转录因子Tamyb59的克隆及表达分析

为进一步挖掘小麦逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究小麦逆境胁迫响应机制,从前期转录组结果中筛选出1个编码MYB蛋白的基因,暂命名为Tamyb59,通过PCR技术扩增Tamyb59的全长;利用NCBI和DNAMAN软件进行基因序列比对和保守结构域的分析;利用Expasy和TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、亲水系数分析;采用MEGA 6. 0软件构建系统进化树;构建pMDC83-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。采用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,并利用SAS数据处理软件进行差异显著性分析。结果表明:该基因含有典型的SANT保守结构域,CDS序列全长为522 bp,编码173个氨基酸,编码蛋白分子质量为19. 7 ku,理论等电点为7. 61。基因系统进化分析结果表明,Tamyb59与山羊草、粳稻、玉米等9种植物MYB转录因子有52. 0%～85. 6%的同源性,其中与谷子的MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,Tamyb59基因编码蛋白定位在细胞核。利用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,组织表达特异性分析显示,Tamyb59基因在小麦根中的表达量较高,茎、叶和幼穗中表达量较低; PEG和盐胁迫处理过程中,Tamyb59基因的表达均呈现先上升后下降的趋势,说明Tamyb59基因对不同非生物胁迫有不同的响应。     

烟草钾转运体NtKT12的克隆及表达分析

克隆烟草钾转运体基因,预测其结构,并分析其进化关系和功能,为研究烟草钾吸收机制奠定基础。采用RT-PCR方法从烟草品种K326中克隆到了一个钾转运体的同源基因,该序列全长为2 532 bp,蛋白编码844个氨基酸,预测分子量为93.1 k Da,等电点为7.2。同源性分析结果显示,该基因与绒毛烟草钾转运体12、林烟草钾转运体12等具有较高的同源性,故命名为NtKT12。生物信息学分析表明,NtKT12具有12个跨膜区。组织表达分析发现该基因在根中的表达量最高。低钾胁迫试验表明,该基因在处理6,24 h后表达量明显高于对照。研究结果为解析NtKT12在烟草钾营养中的功能奠定一定的理论基础。     

大豆转录因子GmWRKY58亚细胞定位及在非生物胁迫下的表达分析

WRKY转录因子在植物响应非生物胁迫,调控抗逆基因的表达方面具有重要作用。为了解析大豆转录因子GmWRKY58基因在非生物胁迫中的功能,从大豆中克隆了GmWRKY58 c DNA全长,推导其编码的氨基酸序列、生理生化特征与进化关系,并研究了其亚细胞定位和在不同组织及非生物胁迫下基因的表达变化。结果表明,GmWRKY58基因c DNA ORF全长为954 bp,编码317个氨基酸。亚细胞定位结果显示,GmWRKY58蛋白质定位于细胞核中。实时荧光定量PCR基因表达分析表明,GmWRKY58在大豆根、茎、叶、花和荚等组织均有表达,根、茎、叶中的表达量明显高于花和荚。在大豆根中,GmWRKY58基因受高盐、干旱、低N和缺Fe等非生物胁迫因子强烈诱导,在高盐胁迫下,基因表达量增加187.4倍;GmWRKY58基因受水杨酸(SA)、低温及低P和低K等诱导轻微,差异表达不显著。由此推测,GmWRKY58转录因子在大豆抗盐、抗旱、低N和缺Fe等非生物胁迫过程中起到重要的调控作用。     

辣椒3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CaGAPB的克隆及表达分析

本实验采用RT-PCR和RACE的方法,我们从辣椒叶片中克隆到3-磷酸甘油醛脱氢酶β亚基基因(CaGAPB)的全长序列,基因编码区共1 359 bp,编码452个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为48.2 kD,等电点6.52;进化树分析表明CaGAPB与同为茄科的番茄、马铃薯、烟草以及葡萄科的葡萄GAPB处于同一进化枝上,表现出较近的亲缘关系,其氨基酸序列同源性达到95%以上;荧光定量分析发现,CaGAPB基因可以被低温处理显著诱导表达,而其他的一些胁迫(NaCl,机械损伤,PEG,甘露醇)和信号分子(乙烯利,H_2O_2,SA)处理均会抑制其表达,同时非生物胁迫DC3000侵染对其表达无影响。综上所述,CaGAPB可能是同辣椒的低温抗性相关,其具体功能有待于进一步的研究。     

银杏GbASR基因的克隆、生物信息学及表达分析

为了明确银杏ASR(ABA-stress-ripening)在应答非生物逆境胁迫中的作用,以便为ASR基因功能、环境胁迫研究提供材料。本研究以银杏(Ginkgo biloba)为材料,利用分子生物学技术对ASR基因进行了克隆,构建pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表达载体,进行亚细胞定位分析。采用序列比对方法分析GbASR蛋白结构域及系统进化;利用qRT-PCR方法进行组织特异性表达及非生物逆境胁迫下的基因表达分析。结果表明,银杏ASR基因编码区全长546 bp,共编码182个氨基酸;蛋白质等电点为5.33,分子量大小为20111.24 Da,为亲水性稳定蛋白;GbASR蛋白含有1个高度保守的ABA/WDS结构域,且与火炬松PtASR蛋白同源性较高;GbASR蛋白定位于细胞核。此外,GbASR基因在银杏幼苗根、茎、叶各组织中均有表达,且在叶部有较高的表达;在高盐、干旱和高温胁迫下,GbASR基因均受诱导,且在不同胁迫处理时间0 h、6 h、24 h和48 h的表达存在显著的差异。以上分析说明GbASR基因参与响应高盐、干旱和高温等非生物胁迫,这为植物的育种及解释ASR基因功能提供依据。     

水曲柳WRKY40基因的克隆及表达模式分析

从水曲柳中克隆一个WRKY基因,序列比对后命名为Fm WRKY40,基因编码区全长为936 bp,编码331个氨基酸(GenBank登录号:KU928310);含有一个WRKY保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY家族第Ⅱ类成员;分子进化分析表明,Fm WRKY40与芝麻WRKY40亲缘关系最近,蛋白相似性为73%;qRT-PCR表达模式分析表明:Fm WRKY40在干旱胁迫和ABA(脱落酸)胁迫下明显上调表达,该基因在水曲柳应答干旱和其他非生物胁迫中可能起重要的调控作用。     

陆地棉干旱胁迫基因GhRBCO的克隆与表达分析

Rubisco蛋白(ritmlose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的上调表达是植物应对非生物胁迫的特征之一。本研究在前期蛋白质组学分析的结果上,利用同源克隆获得陆地棉‘KK1543’在干旱胁迫下差异表达的基因GhRBCO。GhRBCO基因编码区长747 bp,编码249个氨基酸;比对氨基酸序列及同源性分析发现,GhRBCO与其它植物中的RBCO蛋白的一致性较高,表明该基因在进化过程中是相当保守的。系统进化树结果显示,GhRBCO与雷蒙德氏棉、亚洲棉和黄花嵩的同源性最高。利用荧光定量PCR技术在15%PEG胁迫下研究该基因表达变化,表达量在棉花的根、茎和叶中都表现为先缓慢升高后降低的变化趋势,在根中表达量在24 h达到第一次最高;在茎中于12 h表达量最低。该基因的表达量在棉花的根、茎、叶中都呈上调表达水平。结果表明,GhRBCO基因可能参与棉花调节非生物胁迫机制。本研究结果为进一步研究GhRBCO基因的功能奠定了一定的基础。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

花生果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因AhFBA1的克隆与表达

以花生品种花育33为试材, 根据cDNA文库中已知的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 (fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 基因全长序列设计引物, 通过RT-PCR克隆到该基因, 命名为AhFBA1。AhFBA1全长为1489 bp, 开放阅读框为1200 bp, 编码400个氨基酸。预测该基因编码的蛋白含有Glycolytic保守结构域, 可能定位于叶绿体中。蛋白序列比对和进化树分析表明, 花生与大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和菜豆(Phaseolus vulgaris)等豆科植物中的FBA序列相似性最高, 亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示, 在高盐和干旱胁迫下, AhFBA1在花生叶和根中的表达均受明显诱导, 说明该基因可能参与花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控; AhFBA1在花生根和叶中均受ABA的明显诱导, 说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是依赖ABA的。     

黄瓜CsWRKY23基因的生物信息学及表达分析

WRKY转录因子是植物中广泛存在的一种转录因子,参与植物的生物胁迫与非生物胁迫。采用RTPCR克隆黄瓜CsWRKY23基因cDNA序列,对序列进行结构域、基因结构分析,构建系统发育树,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在黄瓜根、叶组织中的表达。结果表明:CsWRKY23的cDNA开放读码框全长1 431bp,含有5个外显子,4个内含子;编码476个氨基酸,含有两个WRKY结构域,编码蛋白的分子量为52.2kDa、等电点为6.43;系统发育分析表明CsWRKY23与拟南芥AtWRKY33同源。qRTPCR结果表明该基因响应低温胁迫,并在根、叶组织中的表达均上调。本研究为进一步鉴定该基因在非生物胁迫的功能奠定了基础。