小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C_(1417)H_(2246)N_(394)O_(423)S_5,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。综上,获得了TaAPX基因的编码区序列,分析发现其响应干旱、低温和盐等逆境胁迫,提示该基因可能与小麦抗逆境机制密切相关。     

烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

植物膜联蛋白基因研究进展

膜联蛋白属于依赖Ca~(2+)的磷脂结合蛋白,组成了一个多功能、多基因的蛋白家族。膜联蛋白家族成员之间序列保守性高,功能结构域相似,一般具有四个保守的内膜联序列区域。植物膜联蛋白参与植物细胞的多个代谢过程,包括参与植物分泌型细胞极性发育、影响植物细胞中关键酶的活性、属于蛋白质磷酸化的底物、参与植物非生物逆境反应、植物细胞中作用位点的多样化。阐明膜联蛋白基因在植物细胞中介导的信号转导机制和调控植物逆境反应机制,为非生物逆境多抗作物品种的培育提供重要的基因资源。     

烟草K~+通道NtSKOR基因的克隆及表达分析

钾通道是植物吸收和转运K~+的主要蛋白质,SKOR属于Shaker通道外整流家族,在植物低钾胁迫反应中起关键作用。为了研究烟草NtSKOR基因在非生物逆境胁迫中的功能和作用,以普通烟草K326为试验材料,同源克隆一个NtSKOR基因c DNA全长,利用实时荧光定量PCR表征基因表达模式,结合生物信息学分析,对蛋白的理化性质、结构域、磷酸化位点和进化关系等进行初步预测。生物信息学分析表明,该基因全长2 484 bp,编码827个氨基酸残基,预测分子量为94. 75 ku,等电点为6.52。该蛋白最大二级结构元件为α-螺旋,最小为β-转角,含有6个跨膜结构域(S1～S6),具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种不同激酶磷酸化位点。进化分析表明,NtSKOR与美花烟草和绒毛状烟草SKOR蛋白同源性高,分别是99%和96%,故命名为NtSKOR。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中根中表达量最高,花中表达量最低。逆境胁迫试验表明,该基因能快速响应低钾、高盐、干旱、H_2O_2、ABA和4℃等非生物逆境处理。由此推测,NtSKOR在烟草非生物逆境胁迫起着重要调节作用,为今后进一步深入研究NtSKOR功能提供了理论基础。     

普通小麦MYB转录因子Tamyb59的克隆及表达分析

为进一步挖掘小麦逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究小麦逆境胁迫响应机制,从前期转录组结果中筛选出1个编码MYB蛋白的基因,暂命名为Tamyb59,通过PCR技术扩增Tamyb59的全长;利用NCBI和DNAMAN软件进行基因序列比对和保守结构域的分析;利用Expasy和TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、亲水系数分析;采用MEGA 6. 0软件构建系统进化树;构建pMDC83-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。采用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,并利用SAS数据处理软件进行差异显著性分析。结果表明:该基因含有典型的SANT保守结构域,CDS序列全长为522 bp,编码173个氨基酸,编码蛋白分子质量为19. 7 ku,理论等电点为7. 61。基因系统进化分析结果表明,Tamyb59与山羊草、粳稻、玉米等9种植物MYB转录因子有52. 0%～85. 6%的同源性,其中与谷子的MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,Tamyb59基因编码蛋白定位在细胞核。利用qRT-PCR分析了基因在不同非生物胁迫处理过程中不同组织的表达特性,组织表达特异性分析显示,Tamyb59基因在小麦根中的表达量较高,茎、叶和幼穗中表达量较低; PEG和盐胁迫处理过程中,Tamyb59基因的表达均呈现先上升后下降的趋势,说明Tamyb59基因对不同非生物胁迫有不同的响应。     

陆地棉干旱胁迫基因GhRBCO的克隆与表达分析

Rubisco蛋白(ritmlose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的上调表达是植物应对非生物胁迫的特征之一。本研究在前期蛋白质组学分析的结果上,利用同源克隆获得陆地棉‘KK1543’在干旱胁迫下差异表达的基因GhRBCO。GhRBCO基因编码区长747 bp,编码249个氨基酸;比对氨基酸序列及同源性分析发现,GhRBCO与其它植物中的RBCO蛋白的一致性较高,表明该基因在进化过程中是相当保守的。系统进化树结果显示,GhRBCO与雷蒙德氏棉、亚洲棉和黄花嵩的同源性最高。利用荧光定量PCR技术在15%PEG胁迫下研究该基因表达变化,表达量在棉花的根、茎和叶中都表现为先缓慢升高后降低的变化趋势,在根中表达量在24 h达到第一次最高;在茎中于12 h表达量最低。该基因的表达量在棉花的根、茎、叶中都呈上调表达水平。结果表明,GhRBCO基因可能参与棉花调节非生物胁迫机制。本研究结果为进一步研究GhRBCO基因的功能奠定了一定的基础。     

毛竹PheWRKY76基因序列及相关表达分析

WRKY转录因子家族在植物生长发育和非生物胁迫应答中发挥着重要的作用。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为材料,克隆PheWRKY76基因并进行相关分析,该基因的开放阅读框全长909 bp,编码302个氨基酸,具有典型的WRKY结构域。PheWRKY76在毛竹的根、茎、叶、花和笋中均有表达,并且受到高盐、干旱和低温等胁迫诱导表达。在不同年龄毛竹的叶片中,随着植株年龄的增加,PheWRKY76基因表达量增加,在不同发育程度的叶片中,老叶PheWRKY76基因表达量较新叶中高,推测该基因可能作为调控因子参与了毛竹的非生物胁迫应答和生长发育调控。     

二穗短柄草BdDREB1 H基因的克隆和表达分析

植物DREB转录因子在应答干旱、低温和高盐等非生物胁迫过程中发挥着重要作用,为了探讨二穗短柄草BdDREB1H转录因子在应答逆境胁迫的作用,对其序列进行了克隆、生物信息学和转录激活分析。然后利用qRT-PCR法对其在根、茎、叶3种组织和冷、干旱、盐和过氧化氢4种非生物胁迫条件下的表达模式进行了研究。结果显示,BdDREB1H转录因子基因全长编码框为735 bp,编码244个氨基酸,相对分子量26.34 ku,理论等电点5.63,不稳定指数(Ⅱ)64.17,为不稳定蛋白质;总亲水平均值-0.261,为亲水蛋白。多序列比对与结构域分析结果表明,BdDREB1H转录因子含有一个典型的AP2结构域,属于AP2/EREBP (APETALA2/ethylene-responsive element binding protein)超家族的DREB亚家族成员。进化分析显示,它与普通小麦的CBF蛋白亲缘关系较近,序列相似性64.44%。酵母单杂分析显示,BdDREB1H转录因子具有转录活性。组织表达分析显示,BdDREB1H基因在根、茎、叶中均有表达,其中在茎中表达量最高。胁迫处理表达分析结果表明,冷处理条件下,BdDREB1H的表达先升高后下降;干旱和氧化胁迫处理条件下,BdDREB1H在2 h后表达水平均显著高于对照;而盐胁迫条件下,BdDREB1H在2 h后表达水平均显著低于对照。这些结果表明,BdDREB1H转录因子可能参与了植物逆境胁迫反应,为进一步探索其在二穗短柄草中的抗逆分子机制奠定了基础。     

大豆中3个Dof转录因子的生物信息学及表达分析

植物Dof转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探明Dof转录因子参与大豆对非生物胁迫的响应,对大豆中3个Dof转录因子(GmDof2.1、GmDof3.1和GmDof4.6)的基因序列进行生物信息学分析。3个Dof基因分别位于不同染色体上,它们所编码的蛋白序列长度为212～305个氨基酸残基,均具有1个保守的Dof结构域。3个Dof蛋白主要定位于细胞核中且含有不同数量的磷酸化位点。启动子序列分析表明,GmDof2.1启动子序列中含有3种与逆境和激素响应相关的元件(ARE、DRE1和MBS),GmDof3.1启动子序列中含有6种与逆境和激素响应相关的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、TGACG-motif、W-box和WUN-motif),GmDof4.6启动子序列中含有7种与逆境和激素响应相关的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、GARE-motif、MBS、TGACG-motif和WUN-motif)。实时荧光定量PCR结果显示,3个Dof基因均可不同程度的响应高盐、干旱、低温和高温胁迫。GmDof2.1和GmDof3.1在大豆根中的表达量最高,GmDof4.6在大豆茎中的表达量最高。由此推测3个Dof转录因子可能在大豆应对非生物胁迫过程中发挥转录调控作用。     

黄瓜独脚金内酯信号转导基因CsMAX2的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactone, SL)是一类新型植物激素,MAX2基因是独脚金内酯信号转导途径中的关键基因。本研究从黄瓜中克隆了CsMAX2基因,其编码715个氨基酸。生物信息学分析表明CsMAX2是一类亲水性蛋白,具有保守的F-box/LRR-repeat结构域,与南瓜中的MAX2基因亲缘关系最近,并且该蛋白与SL合成通路中的D27、CCD7与CCD8等蛋白均有互作关系。启动子分析表明该基因有多个响应非生物胁迫与激素应答的顺式作用元件。表达特性分析表明,CsMAX2在黄瓜的幼茎和幼叶中表达量较高;CsMAX2在黄瓜根与叶中积极响应干旱胁迫诱导上调表达;在盐胁迫条件下,Cs MAX2基因在根与叶中的表达量相反;同时发现CsMAX2也参与了ABA信号转导途径。本研究初步分析了Cs MAX2基因的蛋白特性及表达特性,为CsMAX2在黄瓜独脚金内酯信号转导途径中响应非生物胁迫提供了帮助。     

银杏GbASR基因的克隆、生物信息学及表达分析

为了明确银杏ASR(ABA-stress-ripening)在应答非生物逆境胁迫中的作用,以便为ASR基因功能、环境胁迫研究提供材料。本研究以银杏(Ginkgo biloba)为材料,利用分子生物学技术对ASR基因进行了克隆,构建pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表达载体,进行亚细胞定位分析。采用序列比对方法分析GbASR蛋白结构域及系统进化;利用qRT-PCR方法进行组织特异性表达及非生物逆境胁迫下的基因表达分析。结果表明,银杏ASR基因编码区全长546 bp,共编码182个氨基酸;蛋白质等电点为5.33,分子量大小为20111.24 Da,为亲水性稳定蛋白;GbASR蛋白含有1个高度保守的ABA/WDS结构域,且与火炬松PtASR蛋白同源性较高;GbASR蛋白定位于细胞核。此外,GbASR基因在银杏幼苗根、茎、叶各组织中均有表达,且在叶部有较高的表达;在高盐、干旱和高温胁迫下,GbASR基因均受诱导,且在不同胁迫处理时间0 h、6 h、24 h和48 h的表达存在显著的差异。以上分析说明GbASR基因参与响应高盐、干旱和高温等非生物胁迫,这为植物的育种及解释ASR基因功能提供依据。     

水稻OsGPRP家族基因克隆及其对非生物胁迫的响应

富含脯氨酸和甘氨酸的蛋白基因GPRPs广泛分布于高等植物中,在植物的生长发育和逆境适应中具有重要的作用。为了克隆水稻中的OsGPRP基因,利用生物信息学分析,结合RT-PCR和测序等方法,共获得了3个水稻OsGPRP的cDNA序列,分别编码197,180,170个氨基酸,其蛋白序列均含有3个典型的植物GPRP蛋白保守结构域:N端的XYPP重复、中部富含A的疏水区和C端的HGK重复。为了初步探讨这些OsGPRP基因的功能,利用在线工具Plant CARE database分析,结果发现有3个水稻OsGPRP基因的启动子中包含有许多与植物生长发育、激素和逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。为了进一步探究OsGPRP基因在水稻适应非生物逆境胁迫过程中的生物学功能,利用实时荧光定量PCR分析了3个OsGPRP基因在水稻幼苗适应干旱和低温胁迫过程中的响应情况。结果显示,这些OsGPRP基因对干旱和低温胁迫均有不同程度的响应;在干旱胁迫下,这些OsGPRP基因在水稻幼苗不同组织中的表达量均表现出上升的趋势,表达模式较为相似;而在低温胁迫下,其表达模式却存在一些明显的不同,其中,OsGPRP1和OsGPRP3的表达量上升,而OsGPRP2的表达量却下降。结果表明,3个OsGPRP基因在水稻适应非生物逆境中具有重要的作用。     

小麦组氨酸磷酸转运蛋白TaHP4基因的克隆和表达分析

细胞分裂素在植物生长发育和抵御盐、干旱等非生物胁迫过程中发挥着重要作用。为了研究小麦细胞分裂素信号转导途径中组氨酸磷酸转运蛋白基因的功能和在植物逆境响应中的分子机制,以电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦中克隆了组氨酸磷酸转运蛋白基因Ta HP4。该基因的开放阅读框为456 bp,编码的蛋白长度为151个氨基酸,推测的蛋白分子量为17.71 ku,等电点为9.09,属于碱性蛋白,具有一个HPt结构域和一个负责磷酸基团传递的保守的组氨酸位点。多序列比对和系统进化树分析表明,Ta HP4与水稻和玉米中不含保守组氨酸位点的Os PHP1-Os PHP3和Zm HP4亲缘关系较近,相似性为62.3%~88.7%;而与小麦中前期已经克隆的Ta HP1-Ta HP3亲缘关系较远,相似性仅为32.2%~34.2%。Ta HP4基因表达模式具有较强的组织特异性,在叶、穗、茎等地上部表达量较高,而在根中则表达量很低。另外,Ta HP4基因受盐、干旱和ABA抑制表达,初步推测该基因可能在小麦抵御逆境胁迫的生物学过程中具有重要作用。     

巴西橡胶树逆境相关HbCPK1结构与功能分析

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPK,CPK)在植物对生物和非生物胁迫抗性中具有重要作用。为揭示橡胶树CPK家族成员在橡胶树白粉病抗性中的作用,从巴西橡胶树‘热研7-33-97’叶片中克隆了一个CPK基因,其推导氨基酸含有特征性蛋白激酶家族结构域和4个EF手型蛋白结构域,命名为HbCPK1。该基因在花、叶片、胶乳和树皮中均有表达,在花中表达量最高。干旱、机械伤害和白粉病浸染均显著上调该基因在橡胶树叶片中表达。表明HbCPK1主要受非生物胁迫反应诱导,参与橡胶树对逆境响应,本研究为阐明HbCPK1基因在橡胶逆境胁迫响应下的作用提供理论参考。     

野生大豆胁迫应答膜联蛋白基因的克隆及胁迫耐性分析

野生大豆对非生物胁迫具有优良的抗性,是研究胁迫机制、挖掘抗性基因的理想材料。以耐盐野生大豆为试材,利用前期获得的盐胁迫基因芯片杂交结果和EST数据库,筛选出1个响应胁迫的3'-EST,序列分析表明,该EST编码膜联蛋白(annexin,ANN)。通过改进的5'-RACE获得了该基因的完整编码区,翻译产物与拟南芥膜联蛋白的相似性为57%,将该基因命名为GsANN。GsANN基因的翻译产物具有膜联蛋白家族特征性的结构域,无强烈的亲水/疏水性,无信号肽,无跨膜结构域,与已报道的植物ANN蛋白一致。亚细胞定位结果表明GsANN蛋白在细胞内聚集于质膜附近。GsANN基因在野生大豆叶中受盐及干旱胁迫的诱导,超量表达GsANN基因的拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的敏感性提高,揭示了该基因与植物抗性间的关系。     

大豆GmZAT12基因的克隆和表达分析

锌指蛋白是真核生物中被广泛研究的转录因子,在植物生长发育和逆境应答中发挥重要作用。为了揭示大豆锌指蛋白基因功能,从商豆1201中克隆获得GmZAT12基因的CDS全长序列,并对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。通过烟草表皮注射系统检测GmZAT12蛋白的亚细胞定位情况,采用实时荧光定量(qRT-PCR)技术对GmZAT12基因在大豆不同组织和非生物胁迫中的表达模式进行分析。结果表明,GmZAT12全长516 bp,共编码171个氨基酸,分子质量为19.264 28 ku,理论等电点(pI)为9.02;主要构成元件为无规则卷曲和α螺旋;含有20个磷酸化位点,其中以丝氨酸磷酸化位点为主。序列分析结果表明,GmZAT12蛋白含有2个保守的C2H2锌指结构域;亚细胞定位结果显示,GmZAT12蛋白定位于细胞核。qRT-PCR表达分析结果显示,GmZAT12基因在大豆根、叶片和种子中表达量较高,在花和茎中表达量较低;GmZAT12基因受到高温、低温、NaCl和ABA诱导表达,推测该基因可能参与大豆非生物胁迫应答。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

木薯MeRSZ21a的克隆、生物信息学分析和表达模式分析

在非生物胁迫过程中,植物中SR蛋白(serine/arginine-rich proteins, SR)发挥着重要作用。本研究利用生物信息学分析方法,对木薯MeRSZ21a基因结构、理化性质、结构域、保守基序、系统进化等方面进行了分析,并分析MeRSZ21a在各组织中的表达,以及胁迫后其剪接模式和表达水平。我们之前的研究表明,木薯MeRSZ21a是SR蛋白家族中RSZ亚家族的成员之一。本研究结果表明MeRSZ21a基因全长为2 263 bp,编码160个氨基酸,蛋白大小为18 kD,属于亲水性碱基蛋白。MeRSZ21a含有RRM和zf-CCHC结构域,与野生大豆亲缘关系最近。在3个木薯品种‘W14’、‘Arg7’和‘Ku50’各组织中,MeRSZ21a在发育前期组织中表达量较低,在成熟的侧芽与叶组织器官中表达量较高。胁迫处理后,MeRSZ21a的转录本及表达量发生较大变化,其中叶片中转录本数均上升,并且对木薯进行不同温度(42℃,-3℃)胁迫处理后,根和叶中MeRSZ21a的表达水平显著性上调,表明在响应胁迫过程中,MeRSZ21a发挥着重要作用。这有助于进一步探索木薯MeRSZ21a在植物响应非生物胁迫中的功能。     

向日葵DGATs基因家族的鉴定及表达分析

二酰基甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase, DGAT)在植物油脂代谢和抗逆过程中发挥重要作用。为探究DGAT基因在向日葵(Helianthus annuus L.)中的进化及在油脂积累和非生物胁迫应答中的功能,本研究以拟南芥AtDGATs基因为基础序列,通过同源比对从向日葵基因组中获得18个DGAT同源基因序列,并对其染色体分布、基因结构、蛋白保守结构域、系统进化关系、组织特异性表达以及非生物胁迫下的表达模式进行系统分析。结果表明,向日葵DGATs基因可分为4个亚族(DGAT1、DGAT2、DGAT3和WSD),且同一亚族成员具有相似的基因结构和蛋白保守基序;HaDGATs基因的启动子区富含逆境和植物激素响应相关元件;片段复制是导致该基因家族扩张的主要因素; qRT-PCR结果表明, HaDGAT1、HaDGAT2和HaDGAT3主要在种子发育的早、中期表达,与种子油脂快速积累密切相关,而HaWSDs亚家族基因主要在茎、叶和花中表达。盐、低温、干旱和ABA处理后,多数HaWSDs基因在向日葵根、茎和叶中呈现诱导表达,推测其可能在对逆境胁迫的响应...     

黄瓜CsWRKY23基因的生物信息学及表达分析

WRKY转录因子是植物中广泛存在的一种转录因子,参与植物的生物胁迫与非生物胁迫。采用RTPCR克隆黄瓜CsWRKY23基因cDNA序列,对序列进行结构域、基因结构分析,构建系统发育树,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在黄瓜根、叶组织中的表达。结果表明:CsWRKY23的cDNA开放读码框全长1 431bp,含有5个外显子,4个内含子;编码476个氨基酸,含有两个WRKY结构域,编码蛋白的分子量为52.2kDa、等电点为6.43;系统发育分析表明CsWRKY23与拟南芥AtWRKY33同源。qRTPCR结果表明该基因响应低温胁迫,并在根、叶组织中的表达均上调。本研究为进一步鉴定该基因在非生物胁迫的功能奠定了基础。