应用Dot-ELISA检测禽白血病病毒抗原的研究

以鸽抗鸡劳氏肉瘤病毒(RSV)血清IgG作为包被抗体及酶标抗体的双抗体夹心法Dot-ELISA,检测禽白血病病毒抗原,其特异性及敏感性与澳大利亚ELISA(用兔抗AMV-P_(27)血清IgG作为包被抗体及酶标抗体)相同。可用以检测卵清中禽白血病病毒抗原及用鸡胚或鸡胚细胞生产的各种疫苗中污染的禽白血病病毒抗原。     

禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化

利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)P27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体,以制的酶标兔抗P27作为酶标抗体,在国内首次建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法.该方法对禽白血病P27抗原的最小检出量为5 ng/mL,通过统计学试验证明自制的诊断试剂具有良好的特异性和稳定性.与IDEXX试剂盒的平行实验确定自制诊断试剂S/P＞O.17为阳性判定标准.应用此方法对北京附近鸡场对抽样检测687份蛋清样品,检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到100%.     

严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体检测试剂盒(ELISA)的研制

为建立检测严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)血清总抗体的双抗原夹心ELISA方法并进行初步试用.通过原核表达得到SFTSV-NP重组蛋白,以该蛋白作为ELISA的包被和酶标记抗原,确定抗原的最佳包被浓度和血清稀释度,优化各项试验条件,在此基础上研制试剂盒,并对试剂盒的重复性、特异性等方面进行研究.结果发现抗原最适包被浓度为4.0μg/ml,血清的最佳稀释浓度为1:40,重复性试验表明批内和批间的变异性都低于10﹪.该试剂盒敏感性高、特异性强、重复性良好,可应用于SFTSV的研究和临床检测.     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立BVDV抗原捕获ELISA(AC-ELISA)检测方法,优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为5μg/mL,兔多抗血清最佳质量浓度为10μg/mL;单抗在4℃包被12~24 h,多抗在37℃作用1 h为双抗体的最佳反应条件;酶标抗体最适稀释度1∶10000,最适作用时间为1 h;采用1%BSA和1%明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC-ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品,同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,3种方法符合率很高。研究表明AC-ELISA方法稳定性好,可用于BVDV的临床快速检测。     

H5亚型高致病性禽流感病毒抗原捕捉ELISA诊断方法的建立

本研究在已有H5亚型禽流感病毒特异性单抗基础上,建立了以多抗作为包被抗体、单抗作为检测抗体的抗原捕捉ELISA方法。通过对各个反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为：羊血清1：1600倍稀释;单抗1：10000稀释;酶标抗体最适工作浓度为1：5000倍稀释;单抗反应时间1．5h;酶标抗体作用时间1．5h。特异性试验和敏感性试验结果表明：该方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感病毒的检测。     

犬狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

用狂犬病毒单克隆抗体预包被酶标板,将纯化的狂犬病毒作为检测用抗原,利用捕获包被法建立了间接ELISA法用于犬狂犬病病毒抗体的检测。通过优化ELISA条件,研制试剂盒并应用于犬狂犬疫苗的免疫效果检验。利用研制的试剂盒与RFFIT、商品化同类试剂盒对30份犬血清进行平行检测,总符合率分别为90%和93.33%,与其它几种常见犬病毒抗体阳性血清无交叉反应。试剂盒批内、批间变异系数分别为1.45%～5.79%和2.35%～7.21%,2～8℃保存12个月稳定。基于用单抗预包被后再包被检测抗原,本试剂盒检测样品抗体的灵敏度和稳定性得以显著提高,因此适合于不同来源狂犬疫苗人工免疫犬血清的RV抗体水平监测。     

检测非洲猪瘟病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立

利用非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白不同抗原表位的2株单克隆抗体,1株作为捕获抗体,另1株用辣根过氧化物酶(HRP)标记后作为检测抗体,采用方阵法对ELISA反应条件进行优化,建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果显示,该方法中捕获抗体包被质量浓度为1.25 mg/L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1∶4 000。通过试验确定该方法的临界值为0.299,当样品D₄₅₀值≥0.3,且P/N大于2时,判定为阳性。该双单抗夹心ELISA方法可特异性检测ASFV抗原,其他抗原检测结果均为阴性,特异性强;重复性好,批内和批间变异系数(CV)均小于8%。应用本研究建立的方法与荧光PCR方法同时对225份临床样品进行检测,总符合率为96.89%。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于ASFV抗原的大量样品检测,为ASF防控提供了技术支持。     

基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原ELISA方法的建立及应用

应用制备的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) CC13B毒株E2蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV)抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵试验确定的捕获BVDV抗原的单克隆抗体最佳抗体包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释浓度为1 000倍稀释。对100份BVDV阴性粪便样品进行检测与统计学处理,确定了夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准为待检样品D₄₉₀值≥0.156 7时,检测结果判定为阳性。特异性、敏感性和重复性试验结果显示,建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。以建立的单抗捕获BVDV抗原的夹心ELISA方法,调查了山东、河南和吉林3省部分地区牛群BVDV感染情况,发现上述地区牛群的BVDV感染率低至6%。本研究结果为BVDV感染的诊断、检疫、净化及防制提供了有效的技术手段及流行病学理论依据。     

双抗体夹心ABC-ELISA检测弓形虫循环抗原方法的建立

为检测弓形虫循环抗原,以实现弓形虫急性感染的早期诊断,本研究建立了基于ABC(avidin biotin-peroxidase complex)放大系统的双抗体夹心ELISA方法。通过制备弓形虫排泄分泌抗原(ESA)并免疫动物,经3种抗原的筛选以获得抗循环抗原(CAg)的单抗,以方阵滴定法确定最佳多抗包被浓度和单抗工作浓度,利用夹心法和ABC放大系统建立检测弓形虫循环抗原的夹心ABC-ELISA方法,用该方法对人工感染犬血清和其他阳性血清样本进行检测以确定该方法的检出时间和准确性,并应用于临床样品的检测。结果:获得了3株针对不同抗原表位的单克隆抗体,并对CAg有较高特异性。双抗体夹心ABC-ELISA反应条件:兔多抗包被浓度为3.7μg/mL,生物素标记3A5、3E5和10F5-3单抗在混合工作液中的浓度分别为0.1、0.13和0.12μg/mL。该ELISA方法对ESA最低检测限为11.9 ng/mL,并与隐孢子虫早期感染牛血清、血吸虫尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球虫早期感染鸡血清、犬瘟热急性感染早期血清、犬细小病毒急性感染血清无交叉反应。用该ELISA方法检测人工感染的犬,于感染后2 d血清即显示阳性,该方法能明显区分标准阳性血清和阴性血清。用该方法检测68份猪临床血样(其中包括2份标准阳性血清),检测结果与Nest-PCR结果一致。表明该双抗体夹心ABC-ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于弓形虫急性感染的早期或活动期的诊断。     

夹心ELISA检测鹿粘膜病病毒的研究

建立了检测鹿粘膜病毒 (MDV)抗原的双抗体夹心ELISA。试验方法的最佳工作条件 :抗体包被量为 1 0 0 μg/孔 ,酶标抗体的稀释度为 1∶40 0倍。对吉林省某地鹿场的鹿粪样的检查结果表明 ,该鹿场的MDV阳性率为 32 %。