活性氧参与脂多糖诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7活化诱导凋亡

研究活性氧(ROS)与脂多糖(LPS)诱导后巨噬细胞活化诱导凋亡的关系。体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用不同浓度LPS诱导细胞,添加100μmol/L H2O2增加细胞内ROS,或用姜黄素(7.5μmol/L)降低细胞内ROS;流式细胞术分析细胞凋亡、线粒体膜电位(MMP)和ROS。结果显示,RAW264.7细胞凋亡和细胞内ROS水平均随LPS浓度增加而增加,高浓度的LPS导致MMP下降;与LPS(8μg/m L)单独作用组比,H2O2增加ROS,并导致凋亡细胞百分率增加;姜黄素降低LPS诱导的细胞凋亡,同时减少细胞内ROS。表明活性氧参与LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7活化诱导凋亡。     

牛A型巴氏杆菌高、低毒力株LPS激活RAW264.7细胞TLR4信号通路的比较分析

本研究旨在比较牛A型多杀性巴氏杆菌高毒力株(PmCQ2)和低毒力株(PmCQ6)脂多糖(LPS)对小鼠巨噬细胞RAW264.7内TLR4信号通路的影响。选用体外培养RAW264.7细胞,经LPS刺激后检测细胞内TLR4信号激活及对TNF-α和IL-12p40表达的影响;并利用Western blot检测LPS对IκBα磷酸化及NF-κBp65活化的影响。结果显示,高毒力株LPS_PmCQ2和低毒力株LPS_PmCQ6分别刺激RAW264.7细胞后,均能显著提高TLR4的表达,并诱导细胞因子TNF-α和IL-12p40的分泌表达;LPS_PmCQ2和LPS_PmCQ6均能诱导IκBα磷酸化,促进NF-κBp65核转位,但二者没有显著差异(P>0.05)。本研究表明牛A型多杀性巴氏杆菌高、低毒力株LPS均能参与TLR4介导的小鼠巨噬细胞免疫应答,且二者对TLR4介导的IκBα-NF-κB信号通路的作用无显著差异,暗示牛A型多杀性巴氏杆菌对小鼠巨噬细胞的毒力与LPS无明显相关性,可能由其他毒力因子决定。     

DSS诱导血管内皮细胞ECV304凋亡及机制研究

为了研究葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导血管内皮细胞:ECV304增殖和凋亡的影响。体外培养血管内皮细胞ECV304,采用不同浓度DSS诱导细胞,流式细胞术分析细胞凋亡、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、细胞周期;WST-1法检测细胞增殖抑制率。结果显示,随着DSS浓度的增加细胞凋亡率增加,并导致细胞GOG1期阻滞,细胞内活性氧含量减少,同时线粒体膜电位下降,细胞增殖抑制率明显升高。结果表明,DSS可以抑制血管内皮细胞ECV304增殖并诱导细胞凋亡。     

茶多糖对LPS活化单核巨噬细胞内活性氧的影响

研究红茶多糖对细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的单核细胞氧自由基产生和细胞凋亡的影响,体外培养单核细胞U937,采用LPS和茶多糖处理细胞,用流式细胞术分析茶多糖与细胞膜的结合、细胞内活性氧水平和细胞凋亡。结果显示,茶多糖以浓度依赖的方式与U937结合,添加LPS后,茶多糖与细胞膜结合量减少;茶多糖可减少LPS诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,并降低细胞凋亡和坏死。表明茶多糖可与LPS竞争结合单核细胞,从而降低细胞内活性氧(ROS)的水平,并减少LPS所导致的细胞凋亡和坏死。     

阿魏酸联合连翘苷对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的保护作用

本试验探讨了阿魏酸(FA)与连翘苷(PHI)联合对LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)炎性损伤的保护作用,为中药防治大肠杆菌性奶牛乳房炎提供依据。将BMEC分为空白对照组(Con)、模型组(LPS)、FA组(FA_(15)+LPS)、PHI组(PHI_5+LPS)、低浓度联合用药组(FA_5+PHI_5+LPS)、高浓度联合用药组(FA_(15)+PHI_5+LPS)。FA、PHI预处理BMEC 2 h后,加入LPS诱导12 h,采用流式细胞术检测细胞内氧自由基(ROS)含量及细胞凋亡率;RT-PCR法检测细胞内IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量;试剂盒检测细胞内丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。结果表明:LPS诱导BMEC胞内ROS、IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高;SOD、GSH-Px活性显著降低、MDA含量显著升高;细胞凋亡率显著升高。低、高浓度联合用药组均显著抑制了LPS诱导的BMEC炎症、氧化应激指标变化,减少了细胞凋亡率,且效果优于FA或PHI单独用药组。研究表明,FA、PHI对LPS诱导的BMEC炎性损伤具有协同保护作用。     

谷氨酰胺对BCG诱导小鼠传代巨噬细胞凋亡的调控作用

旨在探讨谷氨酰胺在牛分枝杆菌卡介苗(Bacille Calmette-Guerin vaccine, BCG)感染巨噬细胞过程中对凋亡的调控作用。本文采用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,首先建立了BCG感染致细胞凋亡的细胞模型，采用Western blotting检测凋亡关键因子的表达变化，确定最佳感染条件；进而利用无谷氨酰胺培养基构建谷氨酰胺剥夺模型并结合BCG感染，采用ELISA、免疫印迹、免疫荧光和流式细胞术等技术检测了细胞内谷氨酰胺关键代谢指标的差异变化。通过上述研究，阐明谷氨酰胺对BCG诱导的巨噬细胞凋亡的调控作用，并初步探讨其机制。结果表明，BCG感染显著上调了小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中Caspase 3和PARP的蛋白表达(P<0.001),最佳感染时间为12 h,最佳感染复数为10 MOI,同时BCG感染促进了RAW264.7细胞内谷氨酰胺的分解代谢。剥夺谷氨酰胺后能极显著降低BCG感染后巨噬细胞中谷氨酸(P<0.001)和谷胱甘肽(P<0.01)的含量，极显著增加了细胞内ROS的含量(P<0.001)。同时，抑制谷氨酰胺代谢促进了RA...     

苜蓿黄酮对脂多糖诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

研究苜蓿黄酮对脂多糖(LPS)诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响。将奶牛乳腺上皮细胞分成4个组,即基础培养基、基础培养基中加入1 μg·mL^-1的LPS、基础培养基中加入1 μg·mL^-1的LPS和75 μg·mL^-1苜蓿黄酮、基础培养基中加入75 μg·mL^-1苜蓿黄酮。细胞在37 ℃, 5% CO₂的培养箱中培养。结果表明:1)LPS刺激12 h后奶牛乳腺上皮细胞活性下降,而添加苜蓿黄酮能够极显著抑制LPS诱导下细胞活性的下降(P<0.01)。2)在LPS刺激下,细胞内的活性氧(ROS)浓度升高,而添加苜蓿黄酮能够显著降低其浓度(P<0.05)。3)LPS显著上调细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR2、TLR4和MyD88表达(P<0.01),而苜蓿黄酮能够显著下调细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR2表达(P<0.01或P<0.05)。4)在LPS刺激下,p53、Caspase3、p38和P-p38蛋白的表达显著升高(P<0.01或P<0.05),而添加苜蓿黄酮能够显著降低p53和p38蛋白的表达(P<0.05)。在LPS诱导下,苜蓿黄酮能够通过降低ROS浓度,抑制细胞凋亡,提高细胞活性;可能通过抑制TLR2/MyD88信号通路来降低细胞炎症因子的表达,从而保护细胞免受炎性损伤。     

N-乙酰-半胱氨酸对炎症反应中BV-2细胞的保护作用

为了明确N-乙酰-半胱氨酸(NAC)在LPS诱导的BV-2细胞炎症反应中的保护作用,本研究利用流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)、超氧阴离子自由基(O_2~(·-))和线粒体超氧化物(MitoSOX)水平;ELISA和实时荧光定量PCR法检测IL-1β、IL-6和TNF-α表达;脂质氧化产物丙二醛(MDA)试剂盒检测细胞MDA含量;流式细胞术检测细胞凋亡水平。通过对细胞氧化应激、促炎因子表达、脂质损伤和细胞凋亡的检测,探讨NAC对BV-2细胞炎症反应的保护作用。结果显示,LPS可以使BV-2细胞总ROS、O_2~(·-)和MitoSOX的表达显著上升,加入NAC后ROS、O_2~(·-)和MitoSOX的水平又显著下降。LPS可使BV-2细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量显著升高,加入NAC后IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量显著下降(P0.05)。LPS处理4 h后细胞MDA含量显著增加(P0.05),细胞凋亡水平升高,而加入NAC后MDA含量及细胞凋亡水平显著下降。结果表明,NAC可以抑制LPS引起的BV-2细胞氧化应激,使促炎因子表达减少,同时使BV-2细胞脂质损伤减弱和细胞凋亡水平下降,NAC可对细胞炎症反应中BV-2细胞起到很好的保护作用。     

人参多糖对脂多糖刺激小鼠巨噬细胞的免疫调控作用

本试验旨在研究脂多糖(LPS)刺激条件下人参多糖(GPS)对小鼠单核巨噬细胞形态及免疫功能的调节作用。采用LPS刺激小鼠巨噬细胞(RAW264.7),通过测量不同浓度(1、0.5、0.1 mg/mL)GPS对细胞形态、生物酶活性、促炎症因子分泌及TLR4/NF-κB信号通路mRNA表达量的影响来研究不同浓度的GPS对LPS引起小鼠巨噬细胞免疫应激的调控作用。结果表明:添加GPS能抑制由LPS引起的细胞形态和细胞增殖能力的变化;1 mg/mL GPS能够显著提高巨噬细胞酸性磷酸酶的活性;0.5、1 mg/mL GPS能够显著缓解由LPS刺激引起的碱性磷酸酶活性的降低;不同浓度GPS均能显著降低由LPS诱导的促炎症因子IL-1β、TNF-α水平;LPS刺激显著提高巨噬细胞TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达量,而添加GPS后,巨噬细胞TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达量均表现出不同程度降低(P<0.05)。结果显示,添加GPS可以改善细胞形态,恢复细胞增殖能力,GPS可通过调节TLR4/NF-κB信号通路降低促炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌及表达,减少机体免疫应激反应。     

钙离子超载在镉致大鼠肝细胞凋亡中的作用

拟探讨Ca2+超载在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的作用。采用两步灌流法获得大鼠肝细胞,经过24 h培养,用醋酸镉、醋酸镉与Bapta-AM共同处理肝细胞。用MTT法检测细胞存活率,倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态和凋亡,流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度、ROS生成和ΔΨm变化。结果表明,随着镉剂量的增加和作用时间的延长,细胞变形,坏死细胞和凋亡细胞增多,镉可极显著提高细胞内Ca2+浓度和ROS生成量(P<0.01),极显著降低线粒体膜电位(P<0.01),Bapta-AM可显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低镉的毒性。研究结果提示Ca2+超载在镉致肝细胞凋亡中发挥重要作用。     

钙稳态失衡在镉诱导大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用

用不同浓度醋酸镉（0、5、10、20μmol／L）以及细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM（10μmol／L）单独或联合作用于大鼠大脑皮质神经细胞12h,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞内[Ca2＋];、活性氧（ROS）水平以及线粒体膜电位（△ψm）。结果显示,与对照组相比,各镉染毒组细胞凋亡率、细胞内[Ca2＋]i和ROS水平显著或极显著升高（P〈0．05或P〈0．01）,△ψm显著或极显著降低（P〈0．05或P〈0O．01）。BAPTA-AM联合组与相应镉染毒组相比,细胞凋亡率、细胞内[Ca2＋]i和ROS水平降低,△ψm升高,部分组间差异显著或极显著（P〈0．05或P〈0．01）。结果表明,镉可诱导大脑皮质神经细胞凋亡,细胞内钙稳态失衡在镉诱导大脑皮质神经细胞凋亡中起着重要作用,凋亡机理可能与细胞内钙超栽引起ROS水平升高和△ψm下降有关。     

米托蒽醌通过活性氧诱导大鼠肝癌RH35细胞凋亡的研究

试验旨在探讨米托蒽醌（mitoxantrone,MTN）对大鼠肝癌RH35细胞毒性及其作用机制。以MTT法检测MTN的细胞毒性,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生,Western blotting检测相关蛋白的表达。结果显示,MTN时间和剂量依赖性地抑制RH35细胞的生长;15 μmol/L MTN作用于细胞24、48 h后可使细胞皱缩、变圆,并出芽形成明显的凋亡小体,且其可时间依赖性地诱导凋亡细胞比率的增加及ROS的产生;ROS清除剂NAC可以极显著降低MTN诱导的RH35细胞的ROS的产生和凋亡率（P<0.01）;15 mmol/L NAC可以下调MTN诱导的caspase-3、Bax及CytC表达增加,上调MTN诱导的Bcl-2表达降低。结果提示,MTN通过增加细胞内ROS而诱导RH35细胞发生凋亡。     

P38/MAPK介导的蓖麻毒素诱导小鼠淋巴细胞凋亡信号传导通路的研究

蓖麻毒素属于Ⅱ型核糖体失活蛋白,由具有催化活性的A链和凝集活性的B链组成,二者之间经二硫键连接。本研究旨在探讨蓖麻毒素在诱导小鼠淋巴细胞凋亡过程中信号转导通路的激活反应。通过MTS法检测蓖麻毒素的细胞毒性后,用流式细胞术分析胞内活性氧(ROS)水平,进而通过westernblot研究信号分子的表达。结果表明:在蓖麻毒素诱导小鼠淋巴细胞凋亡的过程中,胞内活性氧水平显著增高(P<0.05),伴随信号转导分子——促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)中磷酸化c-jun氨基末端激酶(JNK1/2)和应激激活蛋白激酶(p38)的表达,另一信号分子胞外调节激酶(ERK1/2)无明显反应;加入信号分子的相应特异性抑制剂后,只有磷酸化p38的表达受到明显抑制。由此可得出:蓖麻毒素诱导淋巴细胞的凋亡极有可能通过激活p38/MAPKs通路来实现。     

感染旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞TLR4及细胞因子的变化

为研究旋毛虫感染对小鼠腹腔巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)及细胞因子的影响,本研究分别取感染前、后不同时期小鼠腹腔巨噬细胞,采用半定量PCR和流式细胞术检测巨噬细胞TLR4的表达量,western blot检测TLR信号传导相关蛋白MyD88和NF-κB相对表达量,并对巨噬细胞培养上清液细胞因子浓度进行测定.结果显示,巨噬细胞TLR4在基因和蛋白水平上表达量变化趋势基本一致,呈双峰状,峰值分别在感染后4d和21 d:旋毛虫感染初期4d左右TLR4表达升高,之后降低,14d左右至最低点,感染后期21 d左右TLR4表达重新升高,然后降低并趋于稳定.MyD88/NF-κB的相对表达量及炎性因子含量变化趋势与巨噬细胞TLR4表达量变化趋势相似.由此表明,小鼠腹腔巨噬细胞TLR4的表达与旋毛虫生活史的不同阶段及抗原密切相关,在旋毛虫不同时期抗原刺激下,经由TLR4/MyD88/NF-κB传导途径活化细胞,继而引起炎性因子分泌发生变化.     

受体相互作用蛋白1(RIP1)对BCG诱导小鼠巨噬细胞凋亡的调控作用

旨在通过构建受体相互作用蛋白1(RIP1)腺病毒干扰载体,研究其对BCG诱导的RAW264.7细胞凋亡相关指标的影响,以探讨其在BCG诱导RAW264.7凋亡过程中的调控作用。笔者构建RIP1腺病毒干扰载体,并转染感染BCG的小鼠RAW264.7细胞系,利用流式细胞仪检测各处理细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位、细胞活性氧水平及细胞周期等指标,并用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示:BCG感染显著上调了RIP1的蛋白表达水平并提高了小鼠巨噬细胞RAW264.7的凋亡率,当RIP1被干扰后,BCG感染后的RAW264.7细胞凋亡率和活性氧水平显著降低,而促凋亡蛋白Bax表达量显著下调,线粒体膜电位和抑凋亡蛋白表达量上调。同时,BCG感染后细胞周期滞留于G_1期。BCG感染可有效上调RIP1表达量并诱导RAW264.7细胞凋亡。RIP1通过下调BCG感染后RAW264.7细胞的线粒体膜电位,上调活性氧含量并提高凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值,使细胞周期阻滞于G_1期从而参与诱导细胞凋亡。     

喜树碱对NIH/3T3细胞TLR3表达及活化的影响

为研究喜树碱(CPT)对小鼠成纤维细胞NIH/3T3中Toll样受体3(TLR3)的表达及活化的影响,本实验利用CCK-8试剂盒测定了CPT在不同浓度下、不同作用时间对NIH/3T3细胞的毒性作用,并确定CPT对NIH/3T3细胞的基本无毒浓度为1μg/mL。通过流式细胞术检测CPT作用NIH/3T3细胞表明,TLR3平均荧光强度与对照组相比显著增强,表明TLR3表达增加。此外,ELISA试剂盒检测结果显示CPT作用后IFN-β表达量增加,并高于阳性对照组,差异极显著(p<0.01)。本研究表明CPT对NIH/3T3细胞的TLR3具有显著的激动作用。     

MPTP在庆大霉素诱导MDCK细胞线粒体凋亡途径中的作用

为研究线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,MPTP)在庆大霉素(gentamicin,GM)诱导MDCK细胞线粒体凋亡中的作用,试验用4 mmol/L GM和2μmol/L抑制剂CsA(cyclosporin A,CsA)单独或联合处理MDCK细胞24 h,流式细胞术检测MPTP开放情况和细胞凋亡率;JC-1探针检测线粒体膜电位的变化;荧光检测线粒体变化;免疫印迹法检测Bax与Bcl-2表达量,Caspase-9、Caspase-3和PARP蛋白活化情况,Cyt C和AIF释放。结果显示,CsA能够显著或极显著抑制GM引起的MDCK细胞MPTP的开放,细胞凋亡率的上升,线粒体膜电位下降,Bcl-2/Bax比值下降,Caspase-9、Caspase-3和PARP蛋白的活化以及Cyt C与AIF的释放(P0.05或P0.01);说明MPTP正向调节GM引起的MDCK线粒体凋亡。     

MKK3抑制巨噬细胞炎性体活化

为了探究MKK3对小鼠巨噬细胞炎性体活化过程中的调控作用,无菌分离培养野生型与MKK3基因缺失小鼠原代腹腔来源巨噬细胞,以LPS联合ATP经典方法诱导炎性体活化,并分别采用Western blot和ELISA的方法分析检测Caspase-1的活化、ASC的表达以及细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌量。结果表明,与野生型小鼠巨噬细胞处理组比较,巨噬细胞缺失MKK3基因Caspase-1活化显著,ASC表达增加,IL-1β分泌也显著增加,而TNF-α分泌量差异不显著。即MKK3抑制小鼠巨噬细胞炎性体活化,对小鼠巨噬细胞炎性体活化具有负调控作用。     

GPX4失活通过JNK通路缓解LPS诱导巨噬细胞炎症反应

【目的】 研究硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidases 4,GPX4）失活如何参与调控脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应及其潜在的分子机制。【方法】 体外培养RAW264.7巨噬细胞,以DMSO为对照,使用0.1~5.0 μmol/L GPX4抑制剂FIN56处理,通过CCK-8法检测细胞活力和Western blotting检测GPX4蛋白表达水平,确定抑制剂最适浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为4组：对照组,添加DMSO培养24 h;FIN56（GPX4抑制剂）组,添加0.5 μmol/L FIN56培养24 h;DMSO-LPS组,DMSO培养24 h后使用LPS （100 ng/mL）刺激3 h;FIN56-LPS组,FIN56培养24 h后使用LPS刺激3 h。各组细胞经培养后,利用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,H₂DCFDA）检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,使用试剂盒法检测细胞内丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平,分别使用ELISA和荧光定量PCR检测促炎细胞因子白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的分泌水平和基因表达量,使用Western blotting法检测Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）信号通路相关蛋白表达水平。【结果】 与DMSO处理相比,0.5 μmol/L FIN56处理巨噬细胞24 h对细胞活性无显著影响（P>0.05）,且显著降低GPX4蛋白表达水平（P<0.05）,故选用0.5 μmol/L FIN56用于后续实验。与对照组相比,FIN56和LPS均显著增加了ROS积累（P<0.05）,而与DMSO-LPS组相比,FIN56-LPS组ROS水平显著升高（P<0.05）。与对照组相比,LPS可显著增加小鼠巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达量和IL-6含量,以及c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kinase,JNK）和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,而FIN56可显著下调LPS诱导的IL-6的mRNA表达量和含量及JNK和c-Jun磷酸化水平（P<0.05）,但对p38蛋白（p38 MAPK,p38）、细胞外调节蛋白激酶（phosphorylate extracellular regulated protein kinases1/2,Erk1/2）蛋白表达水平无显著影响（P>0.05）。【结论】 GPX4失活可有效阻断JNK和c-Jun磷酸化,从而特异性抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。该结果可为以GPX4为靶点研发抗炎治疗策略提供理论依据。     

MAPK抑制剂增强紫杉醇抗肿瘤效应的研究

为了分析紫杉醇作用后促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)表达与磷酸化的改变,以及抑制MAPK信号通路对紫杉醇诱导细胞凋亡和抗肿瘤效应的影响,试验分别采用免疫印记、细胞计数和流式细胞术分析MAPK表达与磷酸化、细胞增殖与凋亡。结果表明:6,12 nmol/L紫杉醇可下调A549细胞MAPK活化相关位点的磷酸化,且随着浓度增加MAPK磷酸化增强;在紫杉醇作用24 h后,抑制MAPK活性可显著增强紫杉醇诱导的细胞凋亡和抗肿瘤效应。说明MAPK抑制剂可增强紫杉醇的抗肿瘤效应。