紫菜薹BrbHLH49基因克隆与功能分析

[目的]本文旨在研究紫菜薹BrbHLH49基因在花青素合成中的功能。[方法]以紫菜薹为材料,通过同源克隆获得BrbHLH49基因全长序列,并与其他物种中的同源序列进行进化树分析;构建pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP载体并转化导入烟草叶片中,研究BrbHLH49蛋白的亚细胞定位;采用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析BrbHLH49基因在紫菜薹和‘四九菜心’(‘CX-49’)不同组织中的表达情况,同时分析野生型和35S∶BrbHLH49-YFP转基因拟南芥中花青素合成相关基因的表达。[结果]BrbHLH49基因含有1 431 bp开放阅读框,编码476个氨基酸,其编码的蛋白定位于细胞核中。在进化过程中BrbHLH49编码的氨基酸序列与甘蓝型油菜和野甘蓝(原变种)同源性最高,亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明,紫菜薹的薹和叶中BrbHLH49相对表达量均显著高于‘CX-49’,且BrbHLH49转基因拟南芥植株中花青素合成相关基因的表达量显著高于野生型。[结论]BrbHLH49蛋白定位于细胞核中。BrbHLH49基因在紫菜薹的薹和叶中高表达,且拟南芥中过表达该基因能显著提高花青素的合成。     

苦荞转录因子基因FtMYC的克隆及其表达与花青素积累的相关性分析

【目的】克隆苦荞FtMYC基因,分析非生物胁迫对FtMYC基因表达及花青素含量的影响。【方法】根据苦荞转录组数据克隆FtMYC基因,对其进行生物信息学分析;通过4℃和UV-B胁迫处理芽期苦荞,分析胁迫后苦荞胚轴和子叶中FtMYC基因表达量与花青素积累之间的相关性。【结果】苦荞FtMYC基因DNA全长1 309 bp,由1个外显子和1个内含子构成,符合GT-AG剪切原则;c DNA序列包括1个1 287 bp的开放阅读框,编码428个氨基酸;在进化树上它与参与花青素调控的其他MYC蛋白聚为一簇;UV-B逆境胁迫处理下,苦荞胚轴中FtMYC基因表达量与花青素含量变化显著性相关(r=0.798,P<0.05),在子叶中则极显著相关(r=0.887,P<0.01);在4℃冷胁迫处理下苦荞胚轴中FtMYC的表达量与花青素积累没有明显的相关性(r=0.744),但在子叶中FtMYC的基因表达与花青素积累显著性相关(r=0.814,P<0.05)。此外,对FtMYC基因启动子的序列分析结果显示,pFTMYC序列包含TATA-Box和CAAT-Box等启动子核心元件以及与光、低温和胁迫应答等相关的功能元件。【结论】FtMYC基因可通过参与花青素代谢调控来参与苦荞对UV-B和寒冷等非生物胁迫的应答和适应。     

芥蓝查尔酮合成酶基因BaCHS的克隆与序列分析

查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成途径的关键基因,在植物发育和逆境反应中起着重要作用.根据已发表的查尔酮合成酶基因序列设计全长引物,以芥蓝(Brassica albograbra)叶片基因组DNA和花蕾cDNA为模板,克隆到了芥蓝查尔酮合成酶基因全长序列,命名为BaCHS.该基因DNA全长为1 263 bp,具一个长度为75 bp的内含子,编码区长度为1 188 bp,编码395个氨基酸.序列比对结果表明,BaCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别.     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

紫苤蓝花青素合成酶基因BocANS的克隆与分析

花青素合成酶是催化无色花色素转变成花青素的关键酶,对编码基因进行克隆和分析,有助于研究植物叶色、果色和花色的形成机理。本研究以紫苤蓝为材料,克隆到一个花青素合成酶基因,并进行了表达和序列分析。结果表明,紫苤蓝花青素合成酶基因BocANS的编码区全长为107 7 bp,编码358个氨基酸;RT-PCR结果表明,BocANS在叶柄、叶片、茎、花柄和花蕾中表达,BocANS的长度、碱基组成与甘蓝和芥菜的序列最为接近,在系统发育树上聚为一组,与不同科植物的花青素合成酶基因差异较大,在发育树上处于不同的分支。     

黄瓜异戊烯基转移酶基因的克隆及序列分析

根据GenBank拟南芥ATIPTs基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从黄瓜S94基因组DNA中克隆出异戊烯基转移酶基因保守区片段;再通过对黄瓜基因组BAC文库的筛选,获得基因的全长序列,命名为cs-ipt,GenBank登录号HQ326777.经序列测定及分析表明,该基因编码序列全长1 005 bp,编码334个氨基酸,氨基酸序列中包含有ATP/GTP结合位点GATGTGKS.同源比对表明该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物的ipt基因都有较高的同源性,其中与杨树的同源性最高为65%.     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增，从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2361bp的DNA片段，该DNA克隆含有1个2081bp的LEAFY同源基因全长序列（FcLFY）。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子，编码398个氨基酸。比对结果表明，金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98％。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

芥蓝Brassica albograbra花青素合成酶基因BaANS的克隆与序列分析

根据NCBI数据库中的已知序列设计简并引物,分别从芥蓝（Brassica albograbra）叶片基因组DNA和cDNA中克隆到了花青素合成酶基因。基因命名为BaANS,该基因全长1 369 bp,具一个长度为292 bp的内含子,编码区长度为1 077 bp,编码358个氨基酸,序列已提交到NCBI,登录号为GU170203。序列比对结果表明,BaANS与甘蓝、拟南芥、紫罗兰、白菜和芥菜等的ANS有较高的相似性。     

葡萄中白藜芦醇合成酶基因的克隆及其转化黄芪研究

利用RT-PCR技术从巨峰葡萄中克隆获得RS基因的全长c DNA序列,并利用农杆菌侵染法转化黄芪。试验结果表明:经Vector NTI 11.0软件分析克隆获得的RS基因全长序列长度为1 241 bp,并带14 bp长度的poly(A)尾巴,包含930 bp的开放读码框(ORF),编码1个含310个氨基酸残基的蛋白质。生物信息学分析结果表明:RS基因编码白藜芦醇合成酶,对RS基因全长序列进行蛋白质结构域分析,证明该基因具有查尔酮合成酶N端保守结构域,其长度为225个氨基酸。对黄芪进行遗传转化结果表明:获得了3棵黄芪转基因阳性植株,通过DNA、RNA以及蛋白质水平证明RS基因已经完全整合到黄芪基因组中并表达。     

冷相关转录因子CBF2基因的克隆及其植物表达载体的构建

从拟南芥Columbia基因组DNA中分别克隆了CBF2基因和低温诱导型启动子Rd29A。测序结果显示：克隆的CBF2基因长725bp,编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性为99．8％;启动子Rd29A全长为956bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99．5％。以双元载体pCAMBIA1301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF2,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件。     

拟南芥2A6基因正义、反义植物表达载体的构建

利用PCR技术从番茄基因组中扩增了长约1.1kb的E8基因启动子,构建了中间表达载体pCAMBI-AE8;利用RT-PCR方法从拟南芥中扩增了长约1 197bp的2A6基因全长cDNA编码区,将其定向插入pCAMBI-AE8,构建了正义植物表达载体pCAMBIAE8-2A6;同时扩增了长约500bp的cDNA片段,定向插入pCAMBI-AE8,构建了反义植物表达载体pCAMBIAE8-2A6anti.以此为基础,可以进一步研究2A6基因的差异表达对转基因拟南芥角果发育的影响,达到揭示2A6基因功能的目的.     

荷斯坦奶牛乳腺LAP基因的克隆与序列分析

为了研究奶牛乳腺防御素基因的表达调控机制,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出LAP基因的核心片段序列,并与NCBI数据库序列比对同源性;进一步扩增其DNA序列中间片段;其后运用反向PCR技术并结合半巢式PCR技术扩增其侧翼的序列。结果表明:序列与NCBI数据库中序列同源性为100%,确认为LAP基因;DNA序列扩增得到1 760 bp的中间序列,并预测了其酶切位点;得到5’侧翼序列107 bp,3’侧翼序列87 bp,经预测发现有转录因子GATA。为进一步研究防御素的防御功能、寻找防御素基因体外表达调控机制以及利用基因工程防治奶牛乳腺炎积累了基本资料。     

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]该研究旨在克隆苦荞中查尔酮合成酶全长基因。[方法]选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料,以从叶片中提取的RNA为模板,应用RACE技术结合CODEHOP引物设计方法克隆苦荞中查尔酮合成酶cDNA序列,通过电子合并获得其全长。设计基因全长特异性引物,以DNA为模板进行PCR扩增出基因序列。应用Clustalxl.81和MEGA4软件进行序列分析和进化树的建立;核酸和蛋白质序列同源性分析应用NCBI的Blastn和Blastp完成。[结果]生物信息学分析表明,该基因全长1906bp,具有一个463bp的内含子序列,编码区长度为1188bp,编码395个氨基酸。Blastn序列比对发现该试验所获得的CHS基因序列与相近物种Rheum palmatum(登录号:DQ205352.1)的CHS基因同源性达86%。[结论]该研究为阐明苦荞生物类黄酮合成的分子基础,探索提高苦荞生物类黄酮含量的有效途径奠定基础。     

核糖体失活蛋白(RIP)基因克隆及其表达载体的构建

以按玉米RIP基因(M83927)序列设计合成的特异性引物,用提取的玉米基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段,测定并克隆玉米的RIP基因。序列分析表明,它们的核苷酸和氨基酸序列与GenBank中登录的CRIP(M83927)的同源性分别为99.90%和100%。RIP与植物表达载体pCAMBIA2301相连构建成为带有35S启动子和polyA终止子的植物表达载体p2301-RIP。     

洋葱花青素合成酶基因的克隆和序列分析

采用PCR法克隆了洋葱的花青素合成酶基因AcANS,并对其进行序列比对和生物信息学分析。结果表明,其开放阅读框为1059bp,编码352个氨基酸残基;具有一个富含AT的内含子,符合GT—AG规则;其蛋白质第210～309肽段含有20G—Fe（Ⅱ）加氧酶家族基因的结构域。     

"大通牦牛"Lfcin基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆“大通牦牛”Lfcin基因,为将该基因应用于饲料工业和养殖业提供依据。[方法]利用PCR技术从“大通牦牛”基因组DNA中获得乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体,送至生物公司测序;将“大通牦牛”与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。[结果]克隆获得了含“大通牦牛”LF（Lactoferrin）第二外显子的DNA序列,共778bp,其中Lfcin基因编码区长75bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;进化树分析表明Lfcin进化树符合物种进化规律。[结论]该研究为Lfcin基因在原核或真核细胞中的表达研究以及进一步研究Lfcin蛋白的生活活性奠定了基础。     

牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的真核表达及纯化

【目的】构建proEM-bPAG9重组表达载体,并在HEK293细胞中转染表达。为进一步抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研究奠定基础。【方法】通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体proEM中,构建proEM-bPAG9重组载体后转到DH5α感受态细胞中,重组质粒转染至哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达,再通过亲和层析纯化bPAG9重组蛋白(rbPAG9),经SDS-PAGE 和 Western Blot 检测rbPAG的表达效果。【结果】通过全基因合成法得到1 182 bp的bPAG9基因片段,构建的重组质粒proEM-bPAG9经双酶切获得约4 369 bp和1 176 bp的两条片段,与预期值相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE 和 Western Blot 鉴定显示,获得相对分子质量约为68 kDa 的bPAG9重组蛋白,通过Ni2+亲和层析纯化后,rbPAG9纯度可达90%。【结论】通过基因优化及真核表达获得分子质量为68 kDa 的rbPAG9重组蛋白。