家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)交叉感染的孢子形态变化及表面蛋白差异

试验探讨了微孢子虫的交叉感染性与孢子表面蛋白的变化。结果表明,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)转主感染桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)后孢子形态变为细长,分离纯化感染前和感染后的孢子表面蛋白,通过SDS-PAGE电泳发现形态变异株出现了34 kD和67 kD的差异带,在相同条带17、30、47、77和114 kD表达量存在明显的差异,但33 kD和43 kD条带表达量没有差异。孢子表面蛋白的差异性表达可能与微孢子虫感染适应性有关,而33 kD和43 kD可能是微孢子虫共有的保守蛋白。     

家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT-α亚基的鉴定和亚细胞定位

CCT(chaperonin containing T-complex polypeptide 1,或称TRiC)是一种广泛存在于真核细胞中的伴侣蛋白,主要参与真核细胞中细胞骨架蛋白β-tubulin和actin的折叠和组装.CCT-α亚基作为单体或复合体在细胞骨架蛋白的折叠和组装中起着关键作用.对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的CCT-α基因(NbCCT-α)进行鉴定和表达分析,该基因包含一个全长1 629 bp的完整ORF,编码由542个氨基酸组成的蛋白质.NbCCT-α的分子质量为59.662 kD,等电点(pI)为5.81,无信号肽和跨膜结构域.亚细胞定位结果表明,NbCCT-α 蛋白位于休眠孢子的细胞质和质膜上,并在孢子萌发结束后转移到胞原质表面.在微孢子虫增殖时期,NbCCT-α蛋白不仅存在于细胞质中,还存在于核周和细胞膜.此外,NbCCT-α基因转录水平从感染后24 h开始升高,感染后96 h时达到最高,暗示CCT-α可能在家蚕微孢子虫的增殖中发挥作用.该研究为进一步探索Nb-CCT-α蛋白的功能奠定了基础.     

两种微孢子虫孢子表面蛋白及对家蚕侵染性的比较研究

对来自家蚕的内网虫属样微孢子虫和家蚕微孢子虫的形态、表面蛋白及侵染性进行了比较研究。内网虫属样微孢子虫孢子显著小于家蚕微孢子虫 ,孢囊中孢子数为 8～ 32个 ,只侵染中肠组织 ,对家蚕无胚胎传染性。SDS UreaPAGE和 2D PAGE图谱显示两种孢子表面蛋白有明显差异。在SDS UreaPAGE中 ,内网虫属样微孢子虫的主要表面蛋白为 2 2kD ,而家蚕微孢子虫为 4 5kD。 2D PAGE显示 ,当上样量为 12 0 μg时 ,内网虫属样微孢子虫孢子表面蛋白斑点有 330多个 ,而家蚕微孢子虫孢子只有 16 0多个 ,其中仅有 10多个相同或疑似蛋白点。家蚕微孢子虫的主要表面蛋白点约有 2 0个 ,以中性偏酸的小分子居多 (<18kD ,pI 5 .4～ 7.2 ) ;内网虫属样微孢子虫有 30多个 ,分布较分散。根据两种孢子都能感染家蚕的特点 ,认为相同或疑似蛋白与是否能够感染有关 ,而大量差异蛋白与对家蚕的感染程度有关。两孢子表面蛋白中的主要蛋白均为差异蛋白 ,可能是孢子表面的结构蛋白。     

家蚕病原性微孢子虫极丝蛋白的研究

从家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,简称N .b)和蓝萤叶甲微孢子虫 (MPa)中抽提了极丝蛋白 (PTP) ,进行SDS PAGE分析。并选择性分离、纯化了N .b孢子中主要极丝蛋白 ,经氨银染色法鉴定其纯度较纯。将N .b孢子中该主要极丝蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 ,用酶联免疫法 (ELISA)测定其效价 ,滴度为 1∶10 2 40 0。利用制得的抗体进行胶体金标记免疫电镜定位观察 ,发现所纯化蛋白确实存在于极丝上。     

柞蚕微孢子虫部分孢壁蛋白的分离鉴定及孢壁蛋白8的序列分析

研究柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成和结构特点,有助于解明柞蚕微孢子虫在侵染过程中与蚕体细胞的互作机制。分别采用煮沸法和Laemmli法分离提取柞蚕微孢子虫总蛋白和孢壁蛋白,回收30kD左右的蛋白条带进行液质联用离子阱电喷雾质谱分析,获得的短肽序列经Mascot在线检索工具进行蛋白同源序列比对,共鉴定出27种具有功能注释的蛋白,有3种注释为孢壁蛋白。其中获得了与家蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NbSWP8)高度同源的柞蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NaSWP8)的基因全长序列。序列分析表明NaSWP8与NbSWP8的氨基酸序列相似性达到90%,且均具有特征性的肝素结合基序,二者的编码基因核苷酸序列的非同义替换率和同义替换率比值(dN/dS)明显小于1,表明孢壁蛋白8基因在2种蚕类微孢子虫中受到纯化选择压力的作用,基因的功能相对稳定。     

家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。     

家蚕微孢子虫的一个Dicer相似蛋白基因的鉴定及系统进化和转录活性分析

Dicer是一种具有RNaseⅢ酶活性的蛋白质,参与RNAi起始阶段siRNA和miRNA的形成,为RNA诱导沉默复合物(RISC)形成的关键因子之一,在基因的转录后调控中扮演重要角色。采用生物信息学方法从家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)全基因组数据中鉴定到一个Dicer相似蛋白(Dicer-like)基因,命名为Nb DCL(Gen Bank登录号:EOB15391)。预测Nb DCL的二级结构中含有RNaseⅢ结构域和dsRNA结合结构域。基于Dicer-like基因的系统进化分析显示,家蚕微孢子虫与柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)的亲缘关系最近,并与真菌形成姊妹枝,说明微孢子虫Dicer-like与真菌的同源基因来自共同的祖先。基因组共线性分析显示,Dicer-like基因及其两侧基因在微孢子虫基因组中的排列顺序具有显著的保守性,但兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)和比氏肠道微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)基因组中的Dicer-like基因在物种分化过程中发生了丢失。对Dicer-like基因和Agronaute相似蛋白基因、转座子的共存分析表明,家蚕微孢子虫等Nosema属微孢子虫均保留了古老的RNAi作用机制。RT-PCR检测被家蚕微孢子虫感染48~240 h的家蚕幼虫中肠中Nb DCL基因均有转录。研究结果为进一步探究家蚕微孢子虫RNAi的调控机制提供了有益线索。     

家蚕微孢子虫蓖麻毒蛋白B链基因RBL463-4的克隆及在毕赤酵母中的表达

基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵母表达载体pPIC-R4。重组质粒pPIC-R4经SacⅠ线性化后,电击导入毕赤酵母X33中,利用博莱霉素(zeocin)筛选获得重组酵母X33/RBL463-4。以2%甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物,结果出现25kD和20kD2种蛋白,其中25kD蛋白与预测融合蛋白大小一致,表明获得了RBL463-4的融合蛋白。研究结果为进一步探究RBL463-4蛋白在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的功能作用奠定了基础。     

家蚕微孢子虫表面抗原蛋白对家蚕致病性的影响

家蚕微粒子病是由家蚕微孢子虫通过食下传染和胚种传染引起的,对蚕业生产影响很大,历来是蚕种的检疫对象,为此对家蚕微孢子虫的研究一直是一个重要课题。除Ｐａｓｔｅｕｒ(1870)提出的母蛾检验外,相继出现了双向免疫扩散法,凝集法,荧光抗体法,酶联免疫吸附法,酶标抗体法,免疫过氧化物酶染色法及单克隆抗体法等方法[1],这些方法各有特色。但基本上都是以识别检测微孢子虫的表面抗原蛋白为基础。河原勇[2]根据微孢子虫表面抗原蛋白的不同将家蚕Ｎｏｓｅｍａ属分为3种类型,即Ｂｏｍｂｙｃｉｓ型、Ｍ11型、Ｍ12型。本文以家蚕微孢子虫的表面抗…     

内部核糖体进入位点介导核糖体翻译起始机制

部分正链RNA病毒基因的蛋白质合成是由其自身的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site,IRES)以非依赖5’甲基化帽状结构来实现的。目前,IRES被分为4类,虽然这4类IRES在对其介导的基因合成目的蛋白的机制不同,但是这些不同蛋白翻译机制是依赖IRES与不同真核翻译起始因子相互作用形成特定的复合物来实现的。真核生物翻译是由起始tRNA(Met-tRNAMeti)/eIF2·GTP三元复合物引发,与翻译因子和40S小亚基结合形成43S复合物,43S复合物在eIF1A协助下与起始密码子结合形成48S复合物,在eIF5·GTP促进下60S亚基与40S亚基结合形成80S核糖体。IRES介导翻译通过eIF4G、IRES与eIF4A结合引导43S复合物与IRES结合。Ⅲ型IRES在无eIF3的参与下与40S小亚基的E位点结合并与eIF2·GTP/initiator tRNA形成48S亚基,在eIF5/eIF5B的调控下与60S亚基形成活化的核糖体进行蛋白质翻译。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原优势区域的鉴定

流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis,JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa）,又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa）,将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。     

家蚕病原性微孢子虫孢子表面蛋白的选择性分离与总蛋白比较分析

选择性分离了Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ孢子表面蛋白和总蛋白，采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测发现，孢子表面蛋白由分子量不同的３种亚基（３２０００、２６０００、２４５００Ｄａ）组成，其总蛋白至少包括２５个条带。同时将从养蚕生产中收集到的两种微粒子ＭＡ－１和ＭＤ－１以及从野外昆虫收集到的微孢子虫Ｐｈａ－Ｍ和Ｈａ－Ｍ与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较，发现不同微孢子虫间蛋白组成有差异。     

微孢子虫侵染研究进展

微孢子虫种类繁多,侵染寄主过程十分复杂,pH值、离子种类及浓度、温度、射线等都能激活孢子发芽侵入寄主.近年来微孢子虫侵染机理研究已从激活因子推进到孢子生理生化的研究.研究表明:微孢子虫孢内糖类物质浓度的变化与孢子内压升高,诱发极丝的弹出密切相关;同时,微孢子虫孢子的表面蛋白、极膜和极管蛋白(PTP)在孢子侵染寄主过程中扮演着重要角色.     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白提取方法的优化研究

分别用SDS法、煮沸法、碱溶法和Brosson法,提取家蚕微孢子虫孢壁蛋白,并对孢壁蛋白及处理后的孢子形态进行比较研究。结果表明,不同方法处理后的孢子形态均保持完整,SDS处理后孢子为短杆状且明显变得粗壮,煮沸处理后孢子变小呈梭形,其他方法处理的孢子均有膨胀现象。SDS-PAGE检测显示,SDS法提取的孢壁蛋白出现3条明显的主带,煮沸法提取的孢壁蛋白出现5条明显的主带,0.1 mol/L KOH提取的孢壁蛋白出现2条主带;而Brosson法提取的孢壁蛋白呈现出20~30条带,体现了家蚕微孢子虫孢壁蛋白组成的复杂性,并适合于孢壁蛋白质组学的研究。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。     

表观健康猪群携带猪链球菌2型毒力因子的分布特征

为了研究钦州市猪链球菌2型(SS2)的毒力因子分布特征,采用多重PCR方法对从我市健康猪扁桃体分离的11株SS2相关毒力基因——荚膜多糖(Cps2J),溶菌酶释放蛋白(Mrp),胞外蛋白因子(EF),溶血素(Sly),进行毒力基因检测。检测结果显示:毒力基因型为Mrp+epf+Sly+共有8株,毒力基因型为Mrp+epf+Sly-共有1株,这两种毒力基因型可归为强毒力基因型,占此次健康猪源毒株的81.8%;另外Mrp-epf-Sly-共有2株,属于弱毒和无毒基因型,占健康猪源毒株的18.2%。通过结果分析,预示我市目前SS2的主要流行菌株是同时具有4种毒力因子的高致病性菌株。     

Comparison of proteome and antigenic proteome between two Neospora caninum isolates

This study was conducted to explore the relationship between two isolates of Neospora caninum (N. caninum) (KBA-2 and VMDL-1) using proteomics. To achieve the goal, proteins of N. caninum tachyzoite lysates of KBA-2 and VMDL-1 were separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE), stained with silver-nitrate and analyzed using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) to compare protein profiles. In addition, proteins separated by 2-DE were transferred to membranes, probed with bovine anti-N. caninum KBA-2 immunoglobulin G, and reactive proteins were visualized and compared between the two isolates. Most spots on 2-DE profiles and antigenic spots on 2-DE immunoblot profiles were located at similar locations in terms of isoelectric point and molecular weight. Proteins common to both isolates included the following: heat shock protein 70, subtilisin-like serine protease, nucleoside triphosphatase, heat shock protein 60, pyruvate kinase, tubulin alpha, tubulin beta, enolase, putative protein disulfide isomerase, actin, fructase-1,6-bisphosphatase, putative ribosomal protein S2, microneme protein Nc-P38, lactate dihydrogenase, fructose-1,6-bisphosphatase aldolase, serine threonine phosphatase 2C, 14-3-3 protein homologue, N. caninum dense granule-1 and NcGRA2. As a consequence, even though N. caninum KBA-2 and VMDL-1 isolates were isolated from geographically distinct locations there were significant homology in the proteome and antigenic proteome profiles. In addition, proteomic approach was verified as a useful tool for understanding of host immune response against different isolates of protozoa.