转人乳铁蛋白基因奶牛多重PCR检测方法的研究

本研究旨在建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品出入境检测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据牛物种特异性基因(mtDNA)设计奶牛内源基因引物,根据外源基因人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,hLF)和新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。本方法敏感、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。     

转人溶菌酶基因奶牛多重PCR快速检测方法的建立

建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品进出境检测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据牛物种特异性基因线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)设计奶牛内源性基因引物,根据外源基因人溶菌酶基因(human lysozyme,hLY)及标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法灵敏、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。     

转基因小鼠的多重PCR快速检测技术

转基因检测技术的标准化可以为转基因法规的制定和转基因产品的标识提供技术支持.采用碱裂解法快速提取鼠尾基因组DNA,用PCR方法检测其中的外源基因结构如cytomegalovirus(CMV)启动子、hGH polyA终止子及目的基因跨膜蛋白66(Transmembrane protein 66,Tmem66),筛选到阳性样品.优化了多重PCR引物退火温度及缓冲液浓度,并探讨了扩增速率对多重PCR的影响.结果表明,此多重PCR方法可得到很好的扩增效果,可用于转基因小鼠外源基因的检测,同时为哺乳动物检测标准的建立提供参考.     

转基因牛多重PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测转基因牛的多重PCR方法,针对牛线粒体16 S rRNA基因(BOS mtD-NA16 S rRNA,BOS)、转基因动物常用标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)、人乳铁蛋白编码基因(human laetoferrin gene,hLF)、人-α-乳清蛋白编码基因(human α-lactalb...     

利用荧光定量PCR法检测转基因绒山羊外源基因整合拷贝数

外源基因拷贝数是转基因动物检测中的重要内容。本实验室使用PiggyBac(PB)转座子系统获得Tβ4-GFP、FGF5s-GFP、VEGF164-GFP 3种转基因类型陕北白绒山羊,为研究其外源基因整合情况,利用荧光定量PCR方法对其外源基因copGFP的整合拷贝数进行检测。以Gluc为内参基因,建立外源基因和内参基因的标准曲线方程,对转基因陕北白绒山羊DNA进行荧光定量PCR,将copGFP/Gluc的比率作为外源基因的拷贝数。同时,选取Tβ4-GFP转基因绒山羊对其整合位点进行检测,以验证拷贝数结果。结果显示:copGFP与Gluc的标准曲线方程分别为,y=-3.230 6x+39.216(R~2=0.998 8)、y=-3.564 8x+38.440(R~2=0.996 0);成功得到9只转基因绒山羊的整合拷贝数;Tβ4-GFP转基因绒山羊整合位点数目和拷贝数检测结果一致。结果表明,利用荧光定量PCR检测转基因绒山羊外源基因整合拷贝数,操作简单、灵敏方便,是一种切实可行的检测方法。     

转基因小鼠多重PCR快速检测方法的建立

以转赖氨酸基因小鼠为研究对象,根据转入基因的载体结构分别设计赖氨酸基因、新霉素抗性基因、转基因启动子及小鼠基因组内参基因特异性引物,优化反应条件,建立转基因小鼠多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法可以用于转赖氨酸基因小鼠的检测,同时为转基因动物检测标准的建立提供试验依据。     

转基因动物细胞中外源基因整合位点的分析

旨在通过测定转基因动物中外源基因在宿主染色体上的整合位点来阐述外源基因的整合机制及对该过程中出现的有关问题进行讨论。本研究以MYF6(Myogenic factor 6)转基因小鼠及FAT-1转基因牛为试验材料,采用TAIL-PCR(热不对称交互式PCR)、hiT AIL-PCR(高效热不对称交互式PCR)及本试验室改进的hiT AIL-PCR法,对转基因动物进行了外源基因的整合位点的检测及测序分析。本研究检测到3个MYF6转基因小鼠和一个FAT-1转基因牛的外源基因插入到染色体上的片段,还获得了大量的未能整合到染色体上的PCR片段。通过对以上片段的测序分析,我们发现重组质粒并不一定是在酶切位点断裂,重组质粒可以发生随机断裂,首尾相连等,外源基因整合如宿主染色体,可以同源重组的方式进行整合,也可以进行随机插入。同时,发现并分析了在转基因动物检测中可能存在的问题。通过对外源基因在转基因动物体内整合位点的分析,能够明确转基因动物的遗传背景,能够为转基因动物的生产提供帮助。     

豆粕饲料中转基因成分的多重PCR快速检测

以大豆内源基因、35 S启动子基因、NOS终止子和35S-CTP4为检测对象,研究了对内源基因与外源基因的引物终浓度配比及退火温度对转基因豆粕多重PCR检测的影响.结果表明,建立的多重PCR方法能够准确的同时检测出豆粕中的内源基因和转基因成分.     

奶牛乳腺炎5种病原菌多重PCR快速检测方法的建立与评价

为建立一种能同时快速检测多种奶牛乳腺炎致病菌的多重PCR检测方法,本研究以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,设计并合成了5对特异性引物,通过方阵法对多重PCR反应体系及反应条件优化,建立了一种能快速检测5种病原菌的多重PCR方法。对各菌种随机组合后利用该多重PCR方法检测,结果显示,该方法能同时快速检测奶牛乳腺炎乳样中5种主要病原菌,而其他病原菌则呈阴性结果,具有较强特异性。分别将化脓隐秘杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、副乳房链球菌、金黄色葡萄球菌菌液10倍倍比稀释后,利用建立的多重PCR方法进行检测,确定该方法敏感性,结果显示,该方法对5种病原菌最低检测浓度分别为:金黄色葡萄球菌6.25×10~4cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5cfu/mL。对临床送检及人工模拟的乳样检测结果显示该方法具有较好符合率及灵敏度。本研究首次建立了对包括副乳房链球菌在内的奶牛乳腺炎致病菌多重PCR检测方法,为快速检测奶牛乳腺炎病原菌提供了可行的技术手段。     

利用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数体系的建立

黑素皮质素受体4(Melanocortin receptor 4,MC4R)基因是影响猪生长肥育性能的主效基因之一,是参与调控体重、采食和能量平衡的关键信号物质。动物转基因技术目前主要应用于生产珍贵蛋白、基因治疗、器官移植、动物品种改良和建立疾病模型等方面。目前人们已经获得了如羊、牛、小鼠、猪等多种转基因克隆动物。确定外源基因的拷贝数和整合位点是对后续外源基因功能探讨和表型研究的前提条件。本研究将MC4R基因转入猪PK15细胞中,挑单克隆,通过3对特异性引物对转染细胞做PCR扩增检测出阳性细胞,实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数,初步建立了检测外源基因拷贝数的实验体系。     

科技简讯

“转基因生物及其产品外源基因检测”通过鉴定新华网消息:据福建检验检疫局透露,由该部门承担的福建省重大科技项目———“转基因生物及其产品外源基因检测技术研究及数据库构建”,目前已顺利通过福建省科技厅组织的专家鉴定。据悉,该项目率先将多重PCR技术应用于转基因生物及产品中常见外源基因的检测,在国内外首次开发了主要食(药)用菌的转基因成分定性PCR检测技术,并将这些检测技术作为原创性内容加入该数据库中。与会专家一致认为,该项目具有较高的技术含量与较强的创新性,成果整体上达到国内领先水平,部分达到国际先进水平。新型药…     

猪源大肠杆菌floR、CTX-M、mcr-1耐药基因多重PCR检测方法的建立

为了建立猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重PCR检测方法,本研究以氟苯尼考耐药基因floR、β-内酰胺耐药基因CTX-M、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因,设计3对特异性引物,通过对多重PCR反应体系及条件的优化,成功建立了多重PCR检测方法。该方法的灵敏度为1.46×10^5CFU/m L,具有高度特异性、敏感性和可重复性。本方法的建立为大肠杆菌中常见耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。     

奶牛子宫内膜炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测奶牛子宫内膜炎常见致病菌的方法,根据致病性大肠杆菌的ycjM基因、化脓隐秘杆菌的plo基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因、乳房链球菌的pauA基因、绿脓杆菌的O抗原乙酰基转移酶基因和奇异变形杆菌的尿素酶合成的正向调节因子R基因设计特异性引物,建立奶牛子宫内膜炎常见致病菌多重PCR检测方法。结果表明,该多重PCR检测方法反应特异性良好,其最佳退火温度为58℃,循环次数30次,各目标菌模板敏感度终质量浓度在4～40μg/L。对11份临床采集样品进行检测,其检测结果与传统鉴定结果一致。本试验建立的多重PCR检测方法,可同时检测6种奶牛子宫内膜炎常见致病菌,为该病的快速检测诊断提供技术支持。     

转FABP基因克隆牛外源基因的稳定性及其粪便对蚯蚓的影响

正(上接第15期)第三部分外源基因的稳定性检测本试验通过每隔1至2个月定期采样两头转基因牛、受体母牛、同饲养环境健康普通秦川牛的粪便、土壤、口腔拭子,提取DNA,PCR检测源基因是否发生基因漂移,进而证明转基因牛外源基因是否稳定。1试验材料1.1试验动物转基因牛1号、转基因牛2号、同饲养环境健康普通秦川牛、受体母牛     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

为建立肠出血性大肠埃希菌O157:H7的多重PCR检测方法,针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因设计5对引物,构建多重PCR反应体系,优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性,并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,敏感性达到5×10~3CFU。从检测阳性样本中均分离到目的菌。应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时,还能对菌株毒力进行初步判定。成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法,为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段,具有良好的应用前景。     

CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

实时荧光定量PCR法检测转基因猪外源基因整合拷贝数

以GFP转基因猪为研究对象,以转铁蛋白受体基因为内参基因,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR建立针对外源基因GFP和内参基因的双标准曲线和方程。对转基因猪基因组DNA中外源基因和内参基因的拷贝数同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在转基因猪中的整合拷贝数。同时,利用Southern-blot进行验证分析。结果显示:实时荧光定量PCR法检测2头转基因阳性猪外源基因拷贝数分别为3和2,2头转基因阴性猪外源基因拷贝数均为0,结果同Southern-blot检测一致。结果表明:实时荧光定量PCR法高通量、灵敏、方便,可以更好的用于转基因猪外源基因整合拷贝数的检测。     

实时荧光定量PCR法检测转基因牛拷贝数

为了检测bfat-1转基因牛的外源基因拷贝数,试验采用绝对定量PCR法鉴定外源基因的拷贝数。结果表明:绝对定量PCR可以准确、有效地检测转基因牛外源基因的拷贝数,标准曲线为lnN=-3.16Ct+40.76(R2=0.994 2),2头转基因牛的外源基因拷贝数分别为4.62±1.03,5.46±1.26。     

应用多重PCR方法检测出血性大肠杆菌O157:H7

选择O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(uidA)分别设计引物,在同一扩增体系中进行PCR反应。在优化好的多重PCR反应条件下,对菌株及其它肠道菌进行检测。试验结果为：O157：H7菌株在250,207,179bp处均出现特异条带。试验结果表明,选择3对引物的多重PCR方法可特异、快速而且灵敏地对大肠杆菌O157：H7进行检测。     

转基因动物及其产品检测技术研究进展

为探索可靠、灵敏的转基因动物及其产品检测技术,从核酸检测和蛋白检测两个方面,综述了转基因动物及其产品不同检测技术的原理、特点及应用,提出了每种检测技术的不足及今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。目前,已经研发的核酸检测技术主要包括多种PCR方法、环介导等温扩增技术、Southern blot技术和染色体原位杂交技术等,蛋白检测方法主要包括酶联免疫吸附检测技术、免疫层析试纸条、Western blot技术、免疫组织化学和免疫荧光技术等。三代测序技术是近年来提出的一种新型基因检测技术,适用于对未知序列转基因动物的分析。随着转基因技术的发展,转基因动物及其产品越来越多,高通量、高灵敏度和低成本的检测技术将成为未来转基因动物及其产品检测的研究重点。