非洲猪瘟病毒pK205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

非洲猪瘟(ASF)传播对我国生猪养殖造成重大危害,开发用于ASF诊断产品已刻不容缓。本研究为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)pK205R蛋白单克隆抗体,构建了能表达ASFV pK205R蛋白的工程菌BL21/pET-pK205R。经IPTG诱导,可表达可溶性的pK205R蛋白。经SDS-PAGE检测,获得的蛋白大小为25 kDa左右。经Western blot鉴定,纯化后的蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应。以纯化的ASFV pK205R蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了12株针对ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体。经间接ELISA方法鉴定,单克隆抗体的效价均不低于1∶80 000。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1及IgG2b,轻链亚类均为κ。通过间接免疫荧光试验(IFA)测定12株单克隆抗体均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒存在交叉反应,且均能与ASFV反应。本研究为建立快速检测非洲猪瘟病毒感染的诊断方法奠定了基础。     

以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,本研究原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的ASFV pK205R蛋白约为44 ku,western blot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、副猪嗜血杆菌及猪大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测灵敏度为1∶2 560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;利用该方法对临床样品检测的结果与国外商品化试剂盒检测结果符合率为100%。本研究建立的ASFV抗体间接ELISA方法为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供技术储备。     

非洲猪瘟病毒pK145R蛋白的原核表达及抗血清的制备

为制备兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,本研究以中国首次分离的ASFV HLJ/18毒株K145R基因的真核表达质粒p CAGGS-Flag-K145R为模板扩增K145R基因,构建重组原核表达质粒p ET-21a-K145R,利用镍亲和层析预装柱纯化p K145R蛋白并免疫新西兰大白兔,制备兔抗ASFV pK145R蛋白多克隆抗体,并通过免疫印迹（WB）、间接免疫荧光（IFA）及免疫沉淀（IP）试验对该抗体进行验证。结果显示：本研究成功构建了原核表达质粒p ET-21a-K145R,将该质粒转化细菌BL21(DE3)获得能够可溶性表达p K145R蛋白的重组菌,分子量约为16.0 kDa;利用高度纯化的ASFV pK145R蛋白,制备了兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,该抗体能够特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-K145R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV K145R蛋白。本实验为深入研究p K145R蛋白的功能及其在ASFV感染致病性中的作用奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

非洲猪瘟病毒（ASFV）p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的Bacmid-p54质粒DNA转染Sf9细胞,出现明显病变后,收获细胞培养上清,在正常Sf9细胞中传三代,获得的杆状病毒命名为rBac-P54。利用SDS-PAGE检测rBac-P54感染后昆虫细胞的蛋白表达情况,并通过间接免疫荧光（IFA）和Western-blot鉴定p54蛋白的免疫原性。结果显示,在感染的Sf9细胞中,p54蛋白能获得高效表达,并可被ASFV阳性血清特异性识别。这表明杆状病毒系统表达的p54蛋白具有良好的免疫原性,为后续开展非洲猪瘟血清学诊断和p54功能研究奠定基础。     

非洲猪瘟病毒无标签重组B602L抗原制备与鉴定

为了获得无标签重组抗原用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测,本研究将B602L与类弹性蛋白多肽(ELP)基因进行融合表达,利用简单、经济的相变循环(ITC)纯化ELP-B602L融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,再用ITC回收重组B602L蛋白;用抗体阳性猪血清对重组B602L进行鉴定;以重组B602L蛋白为包被抗原进行ELISA鉴定。结果显示重组大肠杆菌能正确表达ELP-B602L融合蛋白,纯化融合蛋白纯度大于85%;TEV蛋白酶活性包涵体切除ELP标签的效率大于90%,回收的重组B602L蛋白纯度大于90%,能与抗体阳性猪血清反应;以重组B602L蛋白为包被抗原建立的ELISA与抗体阳性血清反应为阳性,与抗体阴性血清反应为阴性,OD450值与血清稀释倍数具有线性相关性。     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的原核表达与反应原性鉴定

p54蛋白为非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要结构蛋白之一,参与病毒对靶细胞的吸附与进入。为深入研究p54结构蛋白的抗原性,根据GenBank序列号(MK128995)对应的E183L基因序列,设计1对特异性引物扩增其整个CDS区,并克隆至pET-30a(+)载体,构建了表达p54蛋白的重组质粒pET-30a(+)-p54。用BL21(DE3)转化该质粒,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳,可见重组质粒表达出1条分子量约为20 kDa的特异性条带,且重组表达蛋白以融合表达蛋白形式存在于上清。进一步通过His亲和层析法纯化目的蛋白,用ASFV阳性血清进行蛋白质免疫印迹反应,发现表达的重组p54蛋白能与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明p54蛋白表达成功。本研究为ASFV抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

非洲猪瘟EP364R蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒（ASFV）Georgia 2007/1毒株的EP364R基因序列（Gen Bank登录号：FR682468.1）合成EP364R基因序列,通过PCR技术扩增目的基因EP364R,并克隆到p ET-32a（+）载体,成功构建了重组质粒p ET-32a-EP364R,鉴定正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达,纯化后的重组蛋白利用SDS-PAGE、Western blot进行鉴定。以纯化的p ET-32aEP364R重组蛋白为诊断抗原,成功建立了检测ASFV的间接ELISA抗体检测方法。将建立的间接ELISA检测方法与法国ID-Vet非洲猪瘟抗体试剂盒分别对临床84份血清进行检测,总符合率达89.3%,表明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。为ASFV的快速诊断、流行病学调查和血清学抗体检测提供了快速实用的检测手段。     

非洲猪瘟病毒EP364R蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

非洲猪瘟病毒（ASFV）EP364R蛋白是ASFV的ERCC4核酸酶结构域。为了获得具有免疫原性的EP364R蛋白,本研究将ASFV EP364R基因构建到杆状病毒表达载体上,将重组质粒转座DH10Bac感受态中,经过3次蓝白斑筛选,获得重组BacmidEP364R质粒,将Bacmid-EP364R质粒转染至细胞中,收获上清,在正常细胞中传三代,以获得重组杆状病毒rBac-EP364R。使用Western blot和间接免疫荧光（IFA）实验鉴定重组蛋白得到表达及其免疫原性。本研究结果显示,在感染的细胞可检测到EP364R蛋白的表达,并可被His单克隆抗体特异性识别。结果表明杆状病毒系统成功表达EP364R蛋白并具有良好的反应活性,为后续开展ASFV血清学诊断和亚单位疫苗的研究奠定基础。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白在昆虫细胞中的表达

为表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P30蛋白,本研究采用PCR方法扩增ASFV p30基因,并克隆至p OET-1载体中构建重组质粒p OET-P30,将其与flash BAC DNA共转染Sf9昆虫细胞,制备了表达P30蛋白的重组杆状病毒,并通过SDS-PAGE和western blot对重组杆状病毒进行鉴定。结果显示,表达的重组蛋白约为30 ku,能够与His标签单克隆抗体和ASF阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组P30蛋白包被ELISA板对相关抗体进行检测,结果显示该重组蛋白仅与ASFV阳性血清发生反应,而与其他疫病阳性血清均无交叉反应,该抗原具有良好的反应原性。该蛋白的表达为ASF血清学检测方法的建立奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)快速、高效和高通量的血清学诊断方法,本研究针对ASFVPig/HLJ/2018毒株序列CP204L(p30)基因,构建了重组质粒pET-28a-p30,并通过原核表达系统获得ASFV重组p30蛋白,试验发现重组蛋白主要在包涵体中表达.经Western blot鉴定重组p30蛋白的反应原性良...     

多花黑麦草、鸭茅、扁穗牛鞭草、菊苣饲养肉兔效果分析

采用单因子试验设计,选用2月龄健康肉兔24只,随机分成4组,饲喂不同的牧草,即每日分别在基础饲粮(50g)中加等量(500g)多花黑麦草、鸭茅、扁穗牛鞭草、菊苣,测定其对肉兔日采食量、日增重和料重比的影响。结果表明,多花黑麦草、鸭茅饲养肉兔的日增重和料重比与扁穗牛鞭草、菊苣相比,提高显著(P<0.05);肉兔对多花黑麦草的采食量最高(P<0.05);4种牧草饲养肉兔的腹泻指数差异不显著(P>0.05),且均是正常水平。结论为4种牧草均适合饲喂肉兔,其中,多花黑麦草饲养效果最佳,鸭茅次之,扁穗牛鞭草、菊苣的饲养效果较低。     

绵羊痘病毒固原株L2R基因的克隆与生物信息学分析

为分析绵羊痘病毒L2R蛋白的分子特征,本试验提取了绵羊痘病毒固原株（GY）的基因组DNA,设计L2R基因引物,对L2R基因进行扩增,将扩增的基因连接到pGEM-T Easy载体后转化到大肠杆菌Trans 5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行序列测序。利用生物信息学软件对L2R基因序列进行预测分析。结果显示,L2R基因序列含有一个由279个核苷酸组成的开放阅读框,编码92个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量理论值为10.92 ku,理论等电点为6.56。该蛋白质二级结构组成分别是α-螺旋占69.57%,β-折叠占9.78%,无规则卷曲占8.70%,延伸链占11.96%。多序列比对分析结果显示,不同羊痘病毒分离株L2R序列高度保守。进化树分析结果显示,GY株与NK、TU及SA株在一个分支,表明它们之间亲缘关系较近。本试验结果为进一步研究L2R蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础。     

Cloning and Bioinformatics Analysis of L2R Gene of Sheeppox Virus GY Strain

To explore the molecular characteristics of protein L2R from sheeppox virus(SPPV), genomic DNA was extracted from SPPV GY strain. The specific primers were designed and used to amplify the L2R gene from the genomic DNA by PCR. Then the PCR product was ligated into pGEM-T Easy vector. After transformation into E. coli Trans 5α, the positive clones were sequenced and the sequences were analyzed by the bioinformatic softwares. The result showed that L2R gene sequence contained an open reading frame (ORF) of 279 nucleotides and deduced protein consisted of 92 amino acids with the theoretical molecular weight of 10.92 ku and isoelectric point was 6.56. Analysis of secondary structure of protein L2R revealed that α-helix, β-strand, random coil and extended strand were 69.57%,9.78%,8.70% and 11.96%,respectively. Analysis of multiple sequence alignment showed that L2R gene from different capripox virus isolates were highly conserved, phylogenetic analysis showed that GY and NK, TU and SA was in a branch, indicating with a close genetic relationship among them. The present results laid a foundation for further studies of biological functions of protein L2R and interaction among the early proteins of capripox virus.