赭曲霉毒素A无毒ELISA检测

[目的]研究赭曲霉毒素A毒素的替代ELISA检测.[方法]采用噬菌体展示技术筛选赭曲霉毒素A模拟表位,得到赭曲霉毒素A(OTA)模拟表位序列为IR(V)PMV(L)XX(X为任意氨基酸),化学合成法体外合成OTA模拟表位肽,通过化学交联法将OTA模拟表位肽与BSA连接,做成无毒抗原,建立无毒OTA间接竞争ELISA检测方法,同样通过化学交联法将OTA多肽-BSA与HRP相联,建立OTA无毒直接竞争ELISA检测方法.[结果]OTA多肽-BSA间接竞争ELISA检测50％抑制浓度(IC50)为5 ng/ml,OTA多肽-BSA-HRP一步直接竞争ELISA检测法IC50为2.5 ng/ml,二步直接竞争ELISA检测法IC50为2ng/ml.[结论]OTA模拟表位多肽能用于代替OTA毒素作为检测抗原使用,并建立无毒ELISA检测方法.     

基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A方法与酶联免疫法的对比研究

[目的]比较基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A(OTA)方法与酶联免疫法。[方法]建立核酸适配体检测OTA标准曲线,进行样品加标回收率试验,并与酶联免疫法进行比较。[结果]核酸适配体法检测OTA在0.05～10.00 ng/mL具有较好的线性,饲料样品中添加OTA的回收率为92.0%～93.5%,与酶联免疫法相比,2种方法之间具有较好的一致性。[结论]该研究建立的基于核酸适配体检测OTA方法灵敏度高、准确度好,为研究饲料中OTA的快速检测方法奠定基础。     

钙调素拮抗剂三氟拉嗪对犬肾上皮细胞增殖的影响

为探讨钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)对犬肾上皮细胞(MDCK)增殖的抑制作用及对细胞各周期时相的影响,采用细胞计数法、流式细胞术、[γ-32P]ATP掺入外源性底物的液体闪烁法和免疫组化技术,分别测定5、10和15μmol/L浓度的TFP对MDCK细胞增殖的抑制作用、细胞各周期时相的百分率、胸苷激酶(TK)的活性以及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的阳性率。结果表明:给药3 d后,各浓度TFP对MDCK细胞生长均具有明显抑制作用;G0/G1期的细胞比率均显著增加(P<0.05),而S期、G2/M期细胞的比率则有所下降,其中高浓度TFP组显著下降(P<0.05);细胞内TK的活性和PCNA的表达显著降低,呈明显的时间剂量效应关系。说明TFP可通过阻断钙调素信号通路,影响DNA合成和细胞周期而抑制MDCK细胞的增殖。     

赭曲霉毒素A诱导Caco-2细胞的细胞毒性及DNA损伤

【目的】研究不同浓度和时间处理下,赭曲霉毒素A(OTA)对人结肠癌细胞(Caco-2)的细胞生长抑制、氧化损伤以及DNA损伤的影响.【方法】采用0.32、1.6、8、40、200μmol/L OTA处理Caco-2细胞24、48、72h后,利用甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,利用活性氧(ROS)试剂盒检测细胞内的自由基水平,利用彗星试验检测细胞的DNA损伤.【结果】在各个处理时间段内,OTA浓度大于0.32μmol/L时,OTA对细胞存活率都有显著的抑制作用(P0.05);细胞内ROS以及DNA损伤都随OTA浓度的增加而显著升高(P0.05),尤其在0~8μmol/L低浓度范围内,OTA显示了强烈的毒性.【结论】OTA可导致Caco-2细胞存活率降低,引起细胞氧化应激以及DNA损伤,其中ROS水平升高可能是OTA导致Caco-2细胞DNA损伤的原因.     

西藏线上旅游产品消费满意度总体分析

基于OTA平台调查分析西藏线上旅游产品(OTA)消费满意度进行的研究。认为采用线上评分指标利于对线上旅游产品的分析西藏自治区OTA产品消费满意度总体偏好,发展形势乐观。     

赭曲霉毒素A对BHK细胞毒害作用的研究

以叙利亚仓鼠肾细胞(BHK cell)为模型,用噻唑兰(MTT)法检测赭曲霉毒素(ochratoxin A,OTA)对细胞活力的影响,用单细胞凝胶电泳法和DNA梯形条带法检测OTA对细胞DNA的损伤,用黄嘌呤氧化酶法检测细胞中SOD活力的变化,用硫代巴比妥酸(TBA)法测定细胞培养液中MDA的含量.结果显示:OTA对BHK细胞活力的影响呈现时间和剂量依赖性的抑制作用.染毒12 h后,2.5、5、10、20和40 μg·mL-1 OTA剂量组BHK细胞的活力均显著降低(P＜0.05),至染毒24 h,40 μg·mL-1 OTA染毒剂量组细胞活力下降达90%.OTA对BHK细胞DNA的损伤作用同样存在明显的剂量效应关系,与对照组相比,除2.5 μg·mL-1剂量组外,其余各剂量组的彗尾DNA含量和拖尾率差异极显著(P＜0.01),40 μg·mL-1剂量组的细胞拖尾率是对照组的80倍.40 μg·mL-1 OTA处理BHK细胞24 h后检测到特征性的凋亡梯形条带,而对照组则未检测到.OTA作用于BHK细胞使细胞内SOD活力显著降低(P＜0.05),细胞培养液中MDA含量则显著升高(P＜0.05).OTA染毒24 h后,40 μg·mL-1 OTA剂量组细胞内SOD活力降低至对照组的25%,培养液中MDA含量较对照组增高了500%.上述结果表明:OTA对BHK细胞活力的影响与细胞内过氧化物的大量生成和抗氧化酶活力下降有关,且对细胞DNA造成损伤,引起细胞凋亡.     

不同培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果研究

[目的]比较3种培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果。[方法]采用DMEM+10%血清、低血清培养基(MEM-MD-611)、无血清培养基(SFE4Mega)3种培养基制备MDCK细胞单层,分别接种不同稀释度的H9亚型禽流感病毒。然后,分别加入含10μg/ml胰蛋白酶的3种培养基作为维持液,培养病毒,每隔24 h观察其细胞病变,并测定上清HA滴度。[结果]在培养72～96 h时,无血清培养基病毒液的HA滴度高于低血清培养基,而低血清培养基则高于含血清培养基。[结论]3种培养基均可用于制备禽流感病毒抗原,其中无血清培养基、低血清培养基更适用于流感病毒抗原的制备。     

赭曲霉毒素A促进PCV2复制的自噬机制研究

为研究赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)诱导自噬的信号通路机制,通过药物的特异性抑制信号通路中不同激酶的活性,探讨特异性激酶抑制剂在OTA诱导的自噬及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)复制促进中的作用。结果表明:1)OTA能够抑制PCV2感染猪肾细胞株(PK-15)中的蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的活性,从而增强自噬能力;2)胰岛素能够逆转OTA引起的AKT与mTOR磷酸化水平的降低,能够逆反OTA诱导产生的自噬以及PCV2的复制促进;3)OTA能够激活细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)信号通路;4)ERK1/2的抑制剂(U0126)通过降低ERK1/2的磷酸化水平,从而抑制了OTA诱导的自噬及PCV2的复制促进;5)U0126能够减少OTA引起的mTOR磷酸化水平降低的幅度。     

ICA-HPLC检测枸杞中赭曲霉毒素A提取方法的比较

对免疫亲和柱-高效液相色谱法(ICA-HPLC)测定枸杞中赭曲霉毒素A(OTA)的提取方法进行研究。对4种提取液[0.1 mol/L正磷酸∶甲醇∶水(1∶10∶4),0.1 mol/L正磷酸∶甲醇(1∶10),甲醇∶水(4∶1),2%Na HCO3∶15%Na Cl(1∶1)]提取下枸杞干果中OTA含量的回收率进行对比和差异性分析,对最佳方法做准确度和精密度试验,并用此方法检测宁夏市场枸杞OTA污染情况。结果显示,0.1 mol/L正磷酸∶甲醇(1∶10)为最佳提取液,回收率为61.5%~77.19%,变异系数为2.22%~2.83%;以0.1 mol/L正磷酸∶甲醇(5∶50)为提取液、ICA-HPLC法测定枸杞干果中OTA方法稳定、可靠;宁夏市场枸杞OTA检测结果显示不存在污染。     

犬肾细胞系的染色体组型分析与致癌/致瘤性的实验研究

 以人类子宫颈癌细胞系Hela为阳性对照 ,以连传 3代的犬、猫肾原代细胞 (CKC、FKC)为阴性对照 ,对来自国内外不同单位收集的 4株MDCK传代细胞系培养 2 5～ 4 5代的完整活细胞或冻融裂解细胞进行裸鼠致癌 /致瘤实验观察 ,筛选出致癌性极低、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的几株MDCK细胞系用于制苗 ,并建立了相应的细胞种子库和工作库 ,供科研和生产使用 ,4年运转很好。不同代次MDCK细胞系染色体众数所占比率的相差率一般不超过 5 %～ 15 % ,结构畸变率一般为 0～ 3%。研究表明 ,MDCK细胞染色体遗传特征决定致瘤性质 ,并具有种属特异性 ,MDCK细胞不论核型如何 ,始终具有致癌性 ,但其致癌 /致瘤性差 ,只有超二倍体以上细胞才具有高的致癌 /致瘤率 (如YA株的为 2 8/ 5 8) ,亚二倍体细胞的致癌 /致瘤率很低 (其它 3株MDCK细胞的致癌 /致瘤率为 5 / 5 4 ) ,且一般致上皮源性恶性肿瘤 ,多为高中分化腺癌。冻融裂解癌细胞系 (X株Hela、JA株Vero、M株BHK 2 1、YA株MD CK)的致癌 /致瘤性相应降低 ,极低致癌 /致瘤性细胞系 (M株或JC株MDCK)不会因冻融裂解而增加致癌 /致瘤性。证明MDCK细胞系冻融裂解物不致癌 ,降低制苗毒液中细胞系基因含量 ,完全可以将MDCK细胞系 (M ,JB ,JC株 )用于犬五联苗生产。MDCK细胞     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

稳定表达鸡氨肽酶N的MDCK细胞系构建及其对传染性支气管炎病毒感染的影响

为研究鸡氨肽酶N(Chicken aminopeptidase N,c APN)在鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染细胞过程中作用,构建稳定表达c APN的MDCK细胞系。将重组质粒pc DNA3.1-c APN通过脂质体转染到MDCK细胞中并利用G418筛选,克隆纯化获得稳定表达c APN的MDCK细胞系。通过RT-PCR和间接免疫荧光检测表明c APN在MDCK细胞中持续稳定表达。IBV可以感染稳定表达c APN的MDCK细胞并连续传代,该细胞系接种IBV阳性样品24 h即可产生典型细胞融合病变,而对照MDCK细胞接种后没有细胞病变出现。结果表明c APN在介导IBV感染宿主细胞过程中发挥重要作用。     

赭曲霉毒素A和T-2毒素组合对肉鸡免疫病理的影响

研究旨在探讨赭曲霉毒素A(OTA)和T-2毒素组合对肉鸡免疫病理的影响。将481日龄的肉鸡随机分为4组,每组4个重复,每个重复30只鸡。4组在接下来的4周饲喂以下饲粮:第1组饲喂基础饲粮(对照组,霉菌毒素自由添加);第2组饲喂基础饲粮+2000mg·kg-1的真菌剂,第3组饲喂基础饲粮+0.25mg·kg-1的OTA+0.5mg的T-2;第4组饲喂基础饲粮+0.25mg·kg-1的OTA+0.5mg·kg-1的T-2+2000mg·kg-1的真菌剂。饲喂OTA和T-2毒素的饲粮,抗新城疫病毒抗体滴度下降了14%。对肉鸡的脂多糖进行PCR检测,结果表明,在一定程度上,饲喂OTA和T-2毒素降低了白细胞介素-2和干扰素细胞因子mRNA的表达水平,但无显著差异(P0.05)。OTA和T-2毒素的结合,显著降低了白细胞介素-2和干扰素-血清的浓度(P0.05)。病理学组织研究表明,OTA和T-2毒素的结合引起了胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏的异常。赭曲霉素A和T-2的毒性可以被部分真菌抵消,但无显著差异(P0.05)。本次研究中,OTA和T-2毒素的浓度采用的是加拿大食品检验局规定的最大耐受水平之下。试验明确提出了这些毒素的去毒方法,建议我们应该减少饲料中OTA和T-2毒素的最高允许剂量,以提高动物食品链健康和安全。     

基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。     

CdCl_2对MDCK细胞的毒性作用

为了探讨CdCl_2对犬肾上皮(MDCK)细胞的毒性作用,以终浓度为15、25、50、75和100μmol·L~(-1)的CdCl_2处理MDCK细胞,每隔24 h观察细胞形态变化,SDS-PAGE检测细胞蛋白质合成情况,MTT法检测细胞存活率.结果显示:当CdCl_2浓度大于15μmol·L~(-1)时,MDCK细胞的生长受到抑制,细胞贴壁状况变差,细胞变圆,存活率降低,总蛋白质含量减少;CdCl_2浓度越高、处理时间越长,细胞受到的抑制作用越明显.     

霉菌毒素OTA和α-ZOL对Hep G2细胞增殖及氧化损伤的影响

为了研究不同剂量赭曲霉毒素A(OTA)和α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)联合作用对Hep G2细胞毒性的交互作用及其可能机制,试验采用3×3析因试验设计,设OTA浓度和α-ZOL浓度2个因素,OTA浓度水平分别为0、6和12μmol/L,α-ZOL浓度水平分别为0、15和30μmol/L,全组合后共组成9个水平组合.毒素作用时间为48h.用边际均数轮廓图判断细胞毒性和氧化损伤的交互作用,结果发现OTA和α-ZOL联合作用时,细胞毒性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和谷胱甘肽(GSH)含量的交互作用一致,均表现为拮抗效应;且细胞活力的变化与SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性和GSH含量的变化表现为显著性相关(P0.05).结果表明细胞毒性的交互作用为拮抗效应,且氧化损伤是毒素诱发细胞毒性的主要途径之一.     

赭曲霉毒素A对HEK293细胞DNA和组蛋白甲基化修饰酶的影响

探讨了赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)诱导HEK293细胞整体基因组DNA甲基化和组蛋白H3K9甲基转移酶活性变化的剂量效应及可能的调控机制。结果表明,OTA抑制了HEK293细胞的生长,降低了整体基因组DNA甲基化水平,并呈剂量效应关系。随OTA暴露剂量的增加,DNA甲基化转移酶DNMT1 mRNA表达量降低。且本研究首次探究了OTA对组蛋白H3K9甲基化修饰酶的影响。结果显示,OTA引起组蛋白H3K9甲基转移酶活性升高,且H3K9甲基化修饰酶G9a和SETDB1 mRNA表达量在高剂量OTA暴露时显著升高。OTA可能分别通过调控DNMT1、G9a及SETDB1使整体基因组DNA甲基化水平降低和H3K9甲基转移酶活性升高,这可能是OTA导致肾毒性的表观遗传机制。     

犬五联病毒活疫苗制备用犬肾细胞系的建库筛选与检定

 以人类子宫颈癌细胞系Hela为阳性对照 ,以连传 3代的犬、猫肾原代细胞 (CKC、FKC)作为阴性对照 ,对来自国内外不同单位收集的另外 4株MDCK传代细胞系培养 2 5～ 6 7代的完整活细胞进行裸鼠致癌 /致瘤实验观察 ,筛选出致癌性极低、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的 2株MDCK细胞系用于制苗 ,并建立了相应的细胞种子库和工作库 ,供科研和生产使用 ,4年运转很好。不同代次MDCK细胞系染色体众数所占比率的相差率一般不超过 5 %～ 15 % ,结构畸变率一般为 0～ 3%。研究表明 ,MDCK细胞染色体遗传特征决定致瘤性质 ,并具有种属特异性 ,MD CK细胞不论核型如何 ,始终具有致癌性 ,但其致癌 /致瘤性差 (2 3/ 5 9) ,且一般致上皮源性恶性肿瘤 ,多为高中分化腺癌。降低制苗毒液中细胞系基因含量 ,完全可以将MDCK细胞系 (WB和H株 )用于犬五联苗生产。MDCK细胞超二倍体YB株和亚二倍体与超二倍体KA株不能用作病毒活疫苗培养基质。找出了MDCK细胞系的染色体变异率、软琼脂中克隆形成率、对植物凝集素的凝集性和在裸鼠体内形成癌肿的潜力之间的可能相关性 ,发现细胞系染色体数目增加、克隆形成率增高、凝集性增强 ,则致癌 /致瘤性相应提高     

小麦面粉中赭曲霉毒素A的CdSe/ZnS荧光量子点免疫探针检测

构建一种基于荧光量子点免疫探针的小麦面粉中赭曲霉毒素A(OTA)的检测方法。以EDC为活化剂将CdSe/ZnS半导体荧光量子点与OTA单克隆抗体偶联,制备OTA检测探针并评价其检测性能。结果表明:制备的检测探针在3d保存期内具有良好的稳定性。当OTA质量浓度为0.1~0.9μg/L时,检测探针的荧光强度与OTA质量浓度呈线性关系,其相关系数为0.996 3,检出限为0.017 7μg/L。与国标法对照的结果说明,此方法具有可行性。小麦面粉中的加标回收试验结果显示,OTA的回收率为96.0%~102.7%,相对标准偏差不超过4.1%,说明准确性良好。可见,OTA的CdSe/ZnS荧光量子点免疫探针检测方法操作简单、准确度高、结果稳定,有望应用于小麦面粉中OTA的检测。     

适应H9亚型禽流感病毒增殖的MDCK悬浮细胞株的驯化及其生物学特性

本研究通过筛选驯化的MDCK细胞获得无血清悬浮生长MDCK细胞(命名为MDCK-sus),测定该细胞的比生长速率、细胞活力及细胞最大生长密度等生长特性,采用间接免疫荧光法和流式细胞仪检测法比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞流感病毒受体[唾液酸-α-2,3-半乳糖糖链受体(SAα2,3Gal)和唾液酸-α-2,6-半乳糖糖链受体(SAα2,6Gal)]的丰度,用荧光定量PCR检测比较细胞中α-2,3唾液酸转移酶(ST3Gals)基因与α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gals)基因表达水平的差异,通过测定流感病毒血凝HA效价比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞对流感病毒的增殖能力。结果表明,经驯化获得的适合无血清悬浮培养的MDCK-sus细胞,细胞密度最高可达1ml 3.6×106个细胞,最大比生长速率可达1 d 0.56。MDCK-sus细胞表面流感病毒受体SAα2,3Gal的丰度明显高于母体MDCK细胞,ST3Gal转移酶基因表达水平也明显高于母本MDCK细胞。MDCK细胞驯化后增殖禽流感病毒的能力增强,其中H9亚型禽流感病毒AH1102株在MDCK-sus细胞中HA效价达到9lg2(25μl)。MDCK-sus细胞各种生长特性表明,其适于H9亚型禽流感的繁殖,可以为采用悬浮细胞培养禽流感疫苗的大规模工业化生产提供技术支持。