HLA-G1的基因表达、纯化及其活性分析

在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株M基因的原核表达与重组蛋白的复性研究

采用PCR方法从重组质柱pTG19-T-M扩增得到缺失N端疏水区序列的基因片段tM.将tM与原核表达载体pET-32a进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序.结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21细胞中成功地表达了醉繁殖与呼吸病毒重组蛋白pET-tM.表达量为31%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为29 kD的重组蛋白且以包涵体形式存在.8 mol·L~(-1)尿素变性溶解包涵体,再用稀释与透析相结合的方法对重组蛋白进行复性.复性蛋白经Western-blot检测,结果证明复性蛋白可被PRRSV阳性血清识别用.     

Bt菌株中Cry1Ia和Cry2Ab结构域交换突变体的表达形式

前期构建了一系列Cry1Ia和Cry2Ab蛋白的结构域交换突变体,并在Bt菌株中获得了可观的表达。对6种突变体的表达形式及分泌与否进行了分析和检测。结果显示,6种突变体在Bt中以包涵体的形式存在于菌液沉淀中;这些包涵体与正常Cry蛋白形成的晶体不同,不能溶于Na2CO3缓冲液。蛋白印迹法检测结果显示,带有Cry1Ia分泌信号肽的突变体IAA,IIA和IAI蛋白未分泌到胞外,这可能是由于蛋白表达量过快,迅速聚集而形成包涵体,从而无法分泌到胞外。     

耐热木聚糖酶xynB_(64)和红色荧光蛋白Dsred2的融合表达及其应用

[目的]耐热木聚糖酶xynB64的表达研究,探讨利用红色荧光蛋白Dsred2标签简便快捷地检测包涵体复性的效率。[方法]构建重组质粒pET42a-xynB64和pET42a-xynB64-Dsred2,利用宿主菌Rosetta(DE3)进行表达,DNS法测定酶活,并检测其荧光强度和尿素复性的包涵体。[结果]红色荧光蛋白Dsred2促进了目的蛋白可溶性表达,重溶包涵体经激发后发射光波长在583 nm,光强度与可溶性大致成正比。[结论]研究表明红色荧光蛋白Dsred2在包涵体复性中可作为报告蛋白,该结果为工业化复性包涵体提供了检测依据。     

重组蛋白sHLA-G1的原核表达与纯化

为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。     

重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化 

以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。     

水稻密码子优化的cry1Ca 基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

将水稻偏好密码子优化并人工合成抗虫基因cry1Ca通过限制性内切酶酶切的方法构建原核表达载体pET-28bca,成功表达了带6个组氨酸标签的His-cry1ca融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的24%,表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在.对包涵体蛋白进行可溶性处理,亲和纯化出带6个组氨酸标签的融合蛋白,将其作为抗原免...     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达纯化鲤春病毒血症病毒( SVCV) G蛋白,制备特异性单克隆抗体,扩增出鲤春病毒0504分离株G基因片段,并将其克隆至原核表达载体pET-28a (+)中,经诱导表达、裂解离心包涵体,包涵体经His Bind亲和层析柱纯化及尿素浓度梯度复性后,作为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体。结果表明：成功筛选出2株稳定分泌G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1 C5、2 D5,经Western-Blot检测表明,制备的单克隆抗体具有良好的特异性。本研究中成功制备的抗G蛋白单克隆抗体,可为建立新型鲤春病毒检测方法提供工具。     

内含肽融合标签介导的人乙醛脱氢酶2基因原核表达

为获得高活性重组人乙醛脱氢酶2(ALDH2)重组蛋白,研究通过PCR获得ALDH2基因,先后构建克隆和表达载体p GEM-ALDH2和p TYB11-ALDH2。转化的阳性重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示融合蛋白获得大量表达。通过正交试验对表达条件优化设计,结果表明,诱导OD值0.3,30℃,IPTG浓度1.0 mmol·L-1,诱导表达4 h为最优表达条件。由于融合蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性,使用IMPACTTM-CN蛋白纯化系统,经内含肽标签蛋白自裂解洗脱、纯化,获得仅含有几个载体氨基酸的ALDH2蛋白,蛋白浓度为0.045 mg·m L-1。纯化的ALDH2蛋白比活力为462 U·mg-1。     

苦荞过敏原TBa和TBb基因的共表达及其包涵体复性的研究

[研究目的]利用大肠杆菌共表达苦荞过敏蛋白的两个亚基,并对表达产物进行包涵体复性研究和免疫学活性分析;[方法]用已构建的表达质pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠;[结果]表迭蛋白以包涵体的形式存在,ELISA检测表明:复性后的蛋白免疫学活性得到了提高;[结论]由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法.     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。     

重组蛋白PACAP-PTD的制备及其活性鉴定

[目的]制备重组蛋白PACAP-PTD,并对其活性进行鉴定。[方法]设计编码融合蛋白PACAP-PTD基因,克隆到表达载体pKYB,构建重组表达载体pKYB-PACAP-PTD,转化大肠杆菌ER2566中。采用IPTG诱导由PACAP-PTD、内含肽和几丁质组成的融合蛋白表达。利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)介导的纯化系统制备目的融合蛋白PACAP-PTD,并对其活性进行鉴定。[结果]试验所得的目的蛋白经测定分子量,结果与理论值相符,且试验中PACAP-PTD能有效的穿越血脑屏障。[结论]融合蛋白PACAP-PTD的构建和制备为其生物学功能的深入研究奠定了基础,同时可用于改善其用药途径,扩大其应用范围。     

外源基因在原核生物和真核生物中的表达(英文)

[目的]研究外源基因在原核生物和真核生物中的表达。[方法]将带有目的基因的表达载体pTYB2-WF转化大肠杆菌ER2566,用IPTG诱导植酸酶基因表达。用SDS-PAGE验证植酸酶融合蛋白表达情况,并进一步对融合蛋白进行纯化。用毕赤酵母表达系统表达植酸酶基因phyA;构建酵母整合载体pPIC9K-phyA,转化毕赤酵母GS115,构建工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结果]在甲醇的诱导下表达植酸酶,经酶活力的测定,其植酸酶活力达7.3μ/ml,构建了毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结论]甲醇酵母表达机制在分子生物学以及工业应用领域发挥作用。     

新烟草糖基转移酶原核表达质粒的构建及诱导

利用先期从烟草中克隆的一个糖基转移酶基因,通过PCR扩增得到该基因的ORF,将此片段与原核表达载体pTYB1连接,构建重组载体pT,然后转入大肠杆菌,并进行诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物.结果表明,此基因的ORF可在大肠杆菌中表达,但表达产物以包涵体形式存在.     

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA4编码区的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物（Banana bunchy top virus Chinese Zhangzhou,BBTV-ZZ)DNA4编码区，序列分析结果表明，该编码区由351个核苷酸组成，推测其编码一个含116个氨基酸的蛋白质（M.W.14.5ku)，将BBTVDNA4编码区克隆到原核表达载体pTYB2上，构建了该基因的融合表达载体pYTB-B4,SDS-PAGE电泳分析表明，69ku的融合蛋白在大肠杆菌ER2566（DE3）中正确表达，以含表达产物的凝胶为抗原，免疫家兔，制备了BBTVDNA4编码蛋白的特异抗血清，Western blot显示，在Southern blot分析为阳性的转BBTV DNA 4编码区烟草中，14．5ku的BBTV DNA4编码区蛋白得到表达，这为进一步研究BBTV DNA4编码区蛋白在整个植株体内的功能奠定了基础。     

猪轮状病毒VP6基因的原核表达载体构建和表达

根据已报道的猪轮状病毒VP6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-VP6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明:成功构建了重组质粒,而且该片段在大肠杆菌中也成功表达,获得了大小为44 kD的蛋白。     

PBP1基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化

将获得的拟南芥黑芥子酶结合蛋白PBP1基因表达载体pTYB2-PBP1导入大肠杆菌ER2566细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示,PBP1-CBD融合蛋白获得了较好的表达。进一步对PBP1蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳结果显示分离纯化效果较好,所获得的纯化的PBP1蛋白可进一步用于研究PBP1与MBP6的酵母双杂交技术。     

猪丹毒丝菌CbpB基因的克隆表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

利用表达纯化的猪丹毒丝菌(ER)胆碱结合蛋白B(CbpB)建立一种检测ER抗体的间接ELISA方法。克隆扩增ER的CbpB基因并与原核表达载体pGEx-6P-1连接,经PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入E.coil BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot鉴定产物。以纯化重组CbpB蛋白作为包被抗原,通过一系列反应条件优化,建立检测ER抗体的间接ELISA方法(CbpB-ELISA),并用于临床猪血清样品检测。建立该方法的最适条件:包被抗原浓度为1.0 μg·mL^-1,4 ℃过夜;5%脱脂奶粉于37 ℃封闭2 h;血清稀释度为1:100,37 ℃孵育60 min;酶标二抗稀释度为1∶1 000,37 ℃作用45 min;显色时间为37 ℃作用10 min。该方法可特异性地检测ER抗体,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应性;阳性血清稀释至1:12 800时仍可检出;批内及批间变异系数均小于10.00%;与全菌体-ELISA、SpaA-ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western-blot比较,该方法总符合率分别为91.67%、93.33%、86.67%和90.00%,其中阳性符合率分别为92.45%、94.55%、88.89%、90.91%,阴性符合率分别为85.71%、80.00%、66.67%、80.00%。对进行和未进行ER免疫的猪血清样品检测,免疫抗体阳性率为86.67%,感染抗体阳性率为30.50%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为ER的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段。     

猪瘟病毒Erns蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

为制备猪瘟病毒(CSFV)特异性诊断抗原,根据国内CSFV流行毒株的序列合成了其主要的保护性抗原Erns蛋白的基因序列,将合成的基因按设计的酶切位点与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-Erns.用SalI将重组表达质粒线性化后,转化GS115酵母菌.经筛选、鉴定,成功获得了表达CSFV的Erns蛋白的阳性重组酵母菌.该阳性重组酵母菌经甲醇诱导,在培养液上清中可检测到目的蛋白.Western-blot结果显示,该蛋白能特异识别CSFV抗体,且具有很好的反应原性.     

Expression and Purification of Recombinant MP-GFP Protein in Escherichia coli

Guided pesticide is an unique compound resulted from the conjugation with carrier (amino acid, protein, sugars, etc) and the active pesticide ingredient. One of the attributes of the guided pesticide is its potential to accumulate at the site of the damaged points caused by pest or at the site of entry to the target pests, such as via inhalation, cuticular penetration, and oral digestion. Movement protein (MP) is a kind of protein coded by plant virus. A genetic fusion between green fluorescent protein (GFP) and movement protein resulted in the expression of a fluorescent fusion MP-GFP protein, which was fully biologically active in mediating the cell-to-cell spread of virus. In order to obtain a suitable carrier for a pesticide,fluorescent carrier MP-GFP was constructed. It was found that the recombinant MP-GFP protein was the inclusion body.The results indicated that optimized cultural condition for expression of recombinant MP-GFP protein was incubation at 37℃ for 2 h and induction with 0.2 mmol L-1 IPTG (isopropyl-β-dthiogalactopyranoside) at 25℃ for 4 h. MP-GFP protein was purified by using Ni-NTA resin. The expressed recombinant MP-GFP protein had both the fluorescence character of report GFP gene and moving character of movement protein. It could provide a guided carrier for studying the guided pesticide. It could also provide convenience for studying the delivery and distribution of the guided pesticide ingredients in the plant.