东方粘虫中肠V-ATP酶A亚基突变体TSCA的原核表达及复性纯化

根据得到的东方粘虫[Mythimna separate(Walker)]中肠V-ATPase A亚基(VHA-A)基因(VATPA),预测其三维结构,构建定点突变并复性。利用Swiss-Model在线预测VHA-A三维结构,确定突变位点,通过重折叠PCR(Overlap-PCR)技术构建突变基因并将其整合到pET-22b(+)载体上,得到重组质粒pET-22b(+)-TSCA,转入大肠杆菌BL21中表达,最后通过亲和层析纯化包涵体蛋白质并进行透析复性。结果表明,成功构建突变基因和融合表达载体,融合蛋白质以包涵体形式表达,并得到大量纯化的可溶性蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。     

重组死亡素-蜂毒素杂合肽表达·分离纯化的研究

[目的]采用pET-28a系统包涵体表达死亡素-蜂毒素杂合肽。[方法]将死亡素基因重组到pET-28a质粒上,转化到大肠杆菌BL21中构建基因工程菌,SDS-PAGE电泳检测工程菌诱导表达时间,亲和层析纯化目的蛋白。[结果]表达的目的蛋白为包涵体,工程菌诱导表达时间8h最佳。[结论]包涵体方式表达死亡素-蜂毒素可以获得较高的表达量,纯化后蛋白纯度较高。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株M基因的原核表达与重组蛋白的复性研究

采用PCR方法从重组质柱pTG19-T-M扩增得到缺失N端疏水区序列的基因片段tM.将tM与原核表达载体pET-32a进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序.结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21细胞中成功地表达了醉繁殖与呼吸病毒重组蛋白pET-tM.表达量为31%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为29 kD的重组蛋白且以包涵体形式存在.8 mol·L~(-1)尿素变性溶解包涵体,再用稀释与透析相结合的方法对重组蛋白进行复性.复性蛋白经Western-blot检测,结果证明复性蛋白可被PRRSV阳性血清识别用.     

耐热木聚糖酶xynB_(64)和红色荧光蛋白Dsred2的融合表达及其应用

[目的]耐热木聚糖酶xynB64的表达研究,探讨利用红色荧光蛋白Dsred2标签简便快捷地检测包涵体复性的效率。[方法]构建重组质粒pET42a-xynB64和pET42a-xynB64-Dsred2,利用宿主菌Rosetta(DE3)进行表达,DNS法测定酶活,并检测其荧光强度和尿素复性的包涵体。[结果]红色荧光蛋白Dsred2促进了目的蛋白可溶性表达,重溶包涵体经激发后发射光波长在583 nm,光强度与可溶性大致成正比。[结论]研究表明红色荧光蛋白Dsred2在包涵体复性中可作为报告蛋白,该结果为工业化复性包涵体提供了检测依据。     

牛整合素β5亚基基因的构建与原核表达

[目的]构建牛整合素β5亚基（ITGB5）基因,并进行原核表达。[方法]扩增目的基因,将其重组到pET-32a（＋）质粒中,将经鉴定为阳性的重组克隆,转化大肠杆菌感受态细胞表达蛋白后纯化。[结果]从牛甲状腺、扁桃体扩增到目的基因ITGB5;ITGB5基因表达产物的SDS-PAGE结果显示,在88 KD处出现表达产物及纯化后的蛋白;W estern-blot分析表明,抗血清可与原核表达的蛋白特异性结合。[结论]表达、并纯化了ITGB5蛋白。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA N端基因的克隆与原核表达

[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene（D16582）的同源性为99.7%。NcoI和HindⅢ双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白（Marker）相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。     

猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.     

重组麻疯树核糖体失活蛋白表达及其体外抗肿瘤活性研究

[目的]研究重组麻疯树核糖体失活蛋白的表达及其体外抗肿瘤活性。[方法]从麻疯树叶中克隆了curcin基因,在此基础上构建pET-22b/curcin重组表达载体,在大肠杆菌中成功表达29 KD的重组蛋白。[结果]经0.5 mM的IPTG在30℃诱导6 h,重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%,重组curcin以包涵体的形式表达。经溶解、复性、纯化,获得了纯度为95.6%的重组curcin蛋白。[结论]体外研究表明,重组蛋白对A549、HepG2的肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用,其IC50分别为92.246和691.42μg/ml,但是对HELA细胞增殖没有明显抑制作用。