香菇SSR—PCR技术体系的优化及其在遗传多样性分析中的初步应用

为建立稳定的香菇SSR技术体系,采用L16(45)正交试验设计,对影响香菇SSR-PCR的主要因素进行了优化筛选,建立了最佳的反应体系.在20μl反应体系中,包含1.5 mmol/L Mg2+,75 ng模板DNA,0.25 mmol/L dNTPs.0.50 μmoI/L引物及1.5U Taq酶.梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为62℃.以该体系为基础,应用5对引物扩增8个香菇菌株的基因组DNA,扩增条带清晰稳定,聚类分析结果能较好地反映供试菌株的地理来源关系.以0.5的相似性为分割点,8个菌株可分成2大类群.类群Ⅰ主要由北方菌株组成,类群Ⅱ由南方菌株组成.该研究为SSR标记技术在香菇分子生物学研究方面的应用奠定了基础.     

香菇SSR-PCR技术体系的建立及其在遗传多样性分析中的初步应用

摘 要: 利用ISSR-抑制PCR法结合Primer 3软件开发香菇特异性的SSR引物,并采用L16（45）正交试验设计,对影响香菇SSR-PCR的主要因素进行了优化筛选，建立了最佳的SSR-PCR反应体系。在20μl反应体系中，包含1.5mmol/L Mg2+，75ng模板DNA，0.25mmol/L dNTPs，0.50μmol/L引物及1.5U Taq酶。梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为62℃。以该体系为基础，应用5对引物扩增8个香菇菌株的基因组DNA，均能获得理想结果，聚类分析结果能较好地反映供试菌株的地理来源关系。以0.5 的相似性为分割点，8个菌株可分成2大类群。类群Ⅰ主要由北方菌株组成，类群Ⅱ由南方菌株组成。     

亮叶蜡梅ISSR反应体系的建立与优化

为了建立和优化亮叶蜡梅(Chimonanthus nitens Oily.)的ISSR反应体系,对模板DNA的浓度、引物浓度、Mg2+浓度等影响因子进行了筛选.结果表明:在25 μL的反应体系中,含有40 ng模板DNA、1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、2.5μL 10×buffer的扩增效果最好.利用该优化的反应体系,筛选出了12条稳定性强、清晰度高、多态性高的ISSR引物,并对筛选出的12条引物在不同退火温度(51～56℃)下的扩增效果进行了比较,从而确定了每个引物的最佳退火温度.     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

柱花草AFLP反应体系的建立与引物筛选

以柱花草奥克雷品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,对影响AFLP反应体系的主要因素进行了优化,建立了柱花草的AFLP反应体系。结果表明:20μL为最佳反应体系,酶切体系中DNA模板量为1000ng,用5 U EcoR I 37℃酶切2 h、5 U Mse I 65℃酶切2 h效果最佳;分别取5μL酶切液、1μL T4连接酶(5μL/L)、1μL EcoR I接头、1μL Mse I接头、2μL缓冲液(T4DNA酶自带),于22℃下连接10 min效果最佳;预扩增体系中模板稀释15倍、Mg2+浓度为0.75 mmol/L、Taq酶用量为1 U、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为2 ng/μL效果最佳;选择扩增体系中模板稀释20倍、Mg2+浓度为1.25 mmol/L、Taq酶为1 U、dNTPs浓度为0.225 mmol/L、引物浓度为0.4 ng/μL效果最佳。利用热研5号、奥克雷2个品种对8对引物组合进行筛选,筛选出46对引物组合,为利用AFLP标记对柱花草进行分子生物学研究及分子育种奠定基础。     

茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化

对茶树ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶浓度(U/(20μL))、Mg2+浓度(mmol/L)、模板DNA质量浓度(ng/(20μL))、dNTP浓度(mmol/L)、引物浓度(μmol/L))在4水平上进行正交优化试验,筛选出各因素的最佳水平,建立茶树最佳ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶为1.0U/(20μL),Mg2+为2.0mmol/L,模板为40ng/(20μL),dNTP为0.20mmol/L,引物为0.25μmol/L.对茶树ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,确定引物ISSR1、UBC881的最适退火温度分别为52.4、59.0℃.     

黄花苜蓿SSR-PCR反应体系的优化

对黄花苜蓿SSR-PCR扩增体系的反应条件进行了优化,分析了Mg2+浓度、dNTP浓度、DNA模板浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度对PCR扩增结果的影响.结果表明:在25μL的反应体系中,dNTPs的最佳浓度为0.2mmol/L,Mgcl2的最佳浓度为2.0mmol/L,DNA模版最适加入量80ng,引物的最佳浓度为0.16gmol/L,TaqDNA聚合酶的最佳用量为1U.     

新疆野核桃SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

利用正交设计对新疆野核桃序列相关扩增多态性PCR(SRAP-PCR)反应体系中的5个因素(模板DNA、Mg2+、引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶浓度)在5水平上进行优化,对比不同浓度模板DNA对扩增结果的影响,建立了新疆野核桃SRAP最佳反应体系。结果表明,优化的新疆野核桃SRAP-PCR最佳反应体系为:20μL的反应体系中,2.5μg/m L模板DNA、0.4μmol/L引物、2 mmol/L Mg~(2+)、0.2 mmol/L d NTPs、25 U/mL Taq酶U;最佳PCR扩增程序的退火温度为54℃。各因素扩增结果表明,Mg~(2+)浓度对扩增反应结果影响最大,d NTPs浓度影响最小。运用该体系对新疆野核桃样本进行了验证,表明该体系扩增稳定可靠。用该体系对100个SRAP引物组合进行筛选,筛选出15个扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合,为新疆野核桃种质资源研究奠定了基础。     

大花君子兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以大花君子兰为材料研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对君子兰ISSR扩增结果的影响,并对影响PCR反应体系的主要成分及退火温度进行筛选和优化,确立了适合君子兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Mg2+为2.0 mmol/L,模板DNA用量为50 ng/μL,Taq酶0.4 U,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.4 mmol/L。筛选出了13个适宜君子兰遗传分析的ISSR引物,确定最适宜退火温度为52~56℃。     

朝鲜白头翁RAPD反应体系的优化

采用改进的CTAB法提取朝鲜白头翁的基因组总DNA,建立朝鲜白头翁RAPD分析的PCR反应体系,成功进行RAPD扩增.筛选出的最佳PCR反应体系为:25μL反应体系中包括模板DNA 20ng,dNTP 200μmol/L,引物0.4μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1 U,10×Buffer 2.5μL,其余部分为无菌重蒸馏水.