濒危植物珙桐ISSR-PCR反应体系的建立

以珙桐叶片为材料,通过单因子试验分别研究了退火温度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2 浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,建立了适宜于珙桐ISSR分析的扩增体系,即25μl的反应体系中:模板DNA20 ng,Mg2 1.5 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U。     

菊属ISSR反应体系的建立及优化

以菊属野生种和不同类型菊花品种为试验材料,通过正交试验对菊属ISSR-PCR反应体系进行初选,在此基础上对体系中的dNTP、引物、Mg2 、TaqDNA聚合酶、模板DNA等最佳浓度进行了筛选,通过稳定性检测,优化了菊花ISSR-PCR反应体系:总体积20μl,DNA模板量60 ng;引物浓度0.5μmol/L;dNTP浓度100μmol/L;Mg2 浓度1.875 mmol/L;Taq聚合酶1 U。     

菊芋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交试验设计的方法,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度4因素对菊芋ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度及退火温度进行梯度检测。结果表明:菊芋20μl最佳反应体系包括10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。这一优化系统的建立,将为菊芋种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

葛属植物ISSR-PCR扩增条件的正交优化

利用正交试验设计法L9(34),从引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP浓度4种因素3个水平,对葛资源ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对PCR反应的退火温度进行梯度筛选。结果表明,25μL最佳的葛资源ISSR-PCR反应体系是:1×PCR buffer、0.20 mmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2+和0.5 U TaqDNA聚合酶,引物UBC809的最佳退火温度为57.9℃。     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

正交优化法建立沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系

根据正交试验设计的原理,设计了探索性正交试验和细调性正交试验来确定沙打旺ISSR-PCR体系中各成分的浓度。得到既稳定又能扩出最多条带的适合沙打旺的ISSR-PCR最佳反应体系,即20μl的反应体系中含有1×buffer,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.3μmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,DNA模板2.5 ng/μl。然后对沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为54.1℃。这一最佳体系的建立为今后利用ISSR标记技术,研究沙打旺的遗传多样性提供了标准化程序。     

铜鱼ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

采用正交设计方法,对影响铜鱼(Coreius heterodon(Bleeker))ISSR-PCR扩增结果的5个因素,如Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA的浓度,在4个水平上进行了比较优化,建立了适合铜鱼的最佳ISSR-PCR反应体系:在25μL反应体系中含有1.5 mmol/L Mg2+,0.16 mmol/L dNTP,0.2μmol/L引物,1UTaqDNA聚合酶和140 ng模板DNA.检验结果表明,采用该反应体系对铜鱼进行ISSR-PCR扩增可获得多态性高,稳定性和重复性好的电泳条带.     

贯叶连翘ISSR-PCR反应体系的建立与条件优化

[目的]建立贯叶连翘的ISSR-PCR反应体系,并对其条件进行优化.[方法]以贯叶连翘基因组DNA为模板,用L16(45)正交试验设计系统分析引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2浓度、dNTP浓度和模板DNA浓度5种因素对贯叶连翘ISSR-PCR反应扩增结果的影响.[结果]正交试验设计的方法可以用于贯叶连翘1SSR-PCR反应体系的建立,经过优化得到贯叶连翘ISSR-PCR反应体系的最佳条件为:20μISSR-PCR反应体系中含10×PCR buffer,Mg2+浓度1.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度50 U/ml,DNA浓度20 ng/μl,dNTP浓度250 μmol/L,引物浓度0.75 μmol/L.[结论]试验建立的贯叶连翘的ISSR-PCR反应体系重复性好、分辨率高,结果稳定可靠.     

药用植物白术ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,对白术ISSR-PCR反应体系进行优化,确立了适合于白术的ISSR-PCR反应的最佳体系,即在25 μL反应体系中,10×buffer 2.5 μL,Mg2+3 mmol/L,Taq酶0.75U,模板200 ng,dNTP 0.3 mmol/L,引物0.5 μmol/L,通过梯度PCR试验得到相应引物的最佳退火温度为55.0℃.