乳汁中猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测母猪乳汁中猪流行性腹泻病毒(PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,研究以PEDV重组N蛋白和纯化全病毒作为包被抗原,方阵滴定法优化反应条件,建立了两种检测猪乳汁中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组N蛋白和纯化全病毒的最佳包被抗原浓度均为2μg/mL,检测样品最佳检测稀释度分别为1∶10和1∶30,重复性试验的变异系数均小于10%,PEDV阳性乳汁的最低检测稀释倍数分别为1∶320和1∶960,对猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等阳性乳汁均无交叉反应性,两种方法对临床样品检测符合率为97.48%。表明两种方法均具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于检测和评价乳汁中特异性PEDV IgA抗体的水平。     

猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法的建立

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)pET-32a-S1D重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-2l(DE3)感受态细胞,并成功表达目的蛋白S1D。以纯化后蛋白作为抗原,建立了针对乳汁中PEDV的IgA抗体间接ELISA检测方法。确定最佳抗原包被浓度为1μg/mL;乳汁最佳稀释度为1∶10。该检测方法敏感性高,可重复性好。该研究建立的间接ELISA方法为母猪乳汁中猪流行性腹泻病毒IgA抗体的检测提供了一种快速简便的诊断方法。     

猪流行性腹泻IgA、IgG抗体与PEDV抗原相关性研究

为了研究仔猪所吮乳汁中IgA抗体水平与乳汁中PEDV感染情况,探讨母猪免疫猪流行性腹泻疫苗后乳汁与血清中IgA、IgG抗体水平的相关性,临床采集多家规模化猪场母猪群乳汁、血清样品以及发病仔猪所吮母猪乳汁样品。采用实验室已经建立的IgA、IgG抗体ELISA方法,检测临床上猪流行性腹泻疫苗免疫后IgA抗体与IgG抗体的相关性,同时采用RT-PCR方法检测发病仔猪所吮乳汁中PEDV感染情况。结果表明,免疫猪流行性腹泻活疫苗后母猪乳汁中IgA抗体水平与血清中IgA、IgG抗体水平呈现很好的正相关性;当发病仔猪所吮母猪乳汁IgA抗体检测结果为阴性时,其PEDV抗原检测结果为阳性;乳汁IgA抗体检测结果趋于阳性样品临界值时,其PEDV抗原检测结果亦为阳性。结论:乳汁中低水平的IgA抗体很难有效地保护仔猪抵御PEDV感染;乳汁中IgA抗体与血清IgA、IgG抗体呈现很好的相关性,且乳汁中IgA抗体水平远远高于血清;通过IgG抗体水平可以间接反映乳汁中的IgA抗体水平,在初乳样品采集难度较大的情况下,可用于间接评估猪流行性腹泻免疫保护水平。     

猪SIgA分泌片的表达及其多克隆抗体的制备

SIgA是评价黏膜免疫的重要指标,分泌片(SC)是SIgA的特有成分,为了更方便的获得大量的SIgA的分泌片,本研究应用RT-PCR方法扩增出SC基因片段,将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经酶切和测序验证获得pGEX-4T-1-SC重组质粒;将获得的pGEX-4T-1-SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白rSC.重组蛋白rSC经鉴定和纯化后,按常规免疫程序制备多克隆抗体;利用Western blot对抗重组蛋白rSC的多克隆抗体进行鉴定.结果显示,该抗体能特异性识别猪初乳中的SIgA免疫球蛋白,而与猪初乳中的IgG不发生反应.因此,抗SC重组蛋白的多克隆抗体可以作为抗SIgA免疫球蛋白的特异性抗体,为进一步建立SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础.     

基于单克隆抗体捕获的猪血清和乳汁中PEDVIgA抗体间接ELISA方法的建立和评估

为快速准确地评价猪血清和乳汁中猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体水平,本研究从4株PEDV单克隆抗体中筛选得到1株可高效捕获PEDV全病毒粒子(灭活的病毒细胞培养原液)的特异性IgG单克隆抗体8A3,将其用作检测孔内的包被抗体以捕获病毒粒子制备抗原板,从而建立了用于检测母猪血清和乳汁中PEDV特异性IgA抗体的间接ELISA方法。该方法中,单克隆抗体8A3的最适包被浓度为6.0μg/mL,阴性判定临界值(D_(450 nm))为0.34,且在检测中不与常见的猪病毒阳性血清反应。与传统的免疫过氧化物酶单层检测(immuno-peroxidase monolayer assay,IPMA)相比,所建立的ELISA方法检测阳性和阴性血清的符合率分别为98.7%(152/154)和98.0%(145/148);检测初乳和乳汁样品的阳性和阴性符合率分别为100%(60/60)和95.8%(23/24);检测初乳和泌乳期样品中的IgA水平与中和效价的趋势高度相关(kappa=0.835)。本研究建立的检测PEDV IgA的间接ELISA方法灵敏度、敏感性和特异性与传统方法高度一致,可简化检测步骤,适用于大规模评价临床样本乳汁和血清中PEDV IgA抗体的快速检测。     

猪流行腹泻病毒N蛋白表达与PPA-ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪流行性腹泻病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因序列,RT-PCR扩增了长约1 300 bp的N基因片段,连接pET30a表达载体后获得了以可溶性形式表达的重组N蛋白.重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性.以该蛋白作为诊断抗原,建立检测PEDV抗体的PPA-ELISA诊断方法.该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为PEDV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和PEDV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

检测猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗体的间接ELISA方法

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体的间接ELISA方法,初步分析PED灭活疫苗免疫母猪所产仔猪的血清母源特异抗体动态,笔者应用重组PEDV部分纤突(spike,S)蛋白作为检测抗原,建立了基于PEDV S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并用该方法检测了产前4周用PED灭活疫苗免疫母猪的初乳、分娩当天血清及其仔猪1、7、14、21、28和35日龄(d)时血清中的PEDV抗体。结果显示:建立的间接ELISA方法能够特异地检测PEDV抗体,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪轮状病毒的抗血清无交叉反应;敏感性高于免疫过氧化物酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),与IPMA检测结果的符合率为97.14%;批内和批间重复性试验的变异系数小于10%。免疫母猪初乳、分娩当天血清中的PEDV抗体阳性率为100%,初乳比血清中的平均抗体水平低;1d仔猪血清PEDV抗体阳性率为50%,平均抗体水平低,与初乳中的抗体水平接近,7d以后所有仔猪血清全部转为PEDV抗体阴性。建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法;产前用PEDV灭活疫苗给怀孕母猪免疫1次时,其所产仔猪血清中的母源特异抗体阳性率和抗体水平低,且维持时间短暂。     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性分泌性Ig A (PEDV SIg A)抗体,本研究以纯化的PEDV粒子作为包被抗原,以待检初乳或直肠拭子处理样品为检测样品,以HRP标记的鼠抗猪SIg A分泌成分(SC)的单克隆抗体(MAb)为酶标二抗,经过各条件优化,建立了检测初乳和直肠黏膜中PEDV SIg A的间接ELISA方法。并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,PEDV粒子的最佳包被浓度为5.8 ng/孔,HRP标记的鼠抗猪SC抗体的最佳稀释度为1∶3 000。该方法与TGEV、Po RV感染的初乳样品无交叉反应,特异性较强。当初乳的稀释度在1∶6 400时,该ELISA方法检测结果仍为阳性,敏感性较高;批内和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。该方法的建立为研究猪群感染PEDV和PEDV疫苗免疫后特异性SIg A水平及黏膜免疫评价提供了有效的技术手段,具有很好的应用前景。     

猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清特异性IgA抗体的间接ELISA方法,本研究利用融合PCR的方法,将PEDV G2型LNct2a株S蛋白的S1基因片段与人源IgG分子的Fc基因片段融合,克隆于真核表达质粒pAAV-IRES-hr GFP中,构建真核表达质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc并转染293T细胞,表达并纯化了S1蛋白。以纯化的S1蛋白作为包被抗原,以羊抗猪IgA-HRP为二抗,通过优化反应条件,建立了检测PEDV G2型特异性IgA抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行了特异性、敏感性及重复性试验。特异性试验结果显示该方法对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒和圆环病毒的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法能够检测出400倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性变异系数均小于10%。利用该间接ELISA方法和间接免疫荧光方法(IFA)同时对临床样品检测,结果显示二者总符合率为98.6%。本研究建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够用于检测及评价血清中PEDV特异性IgA抗体的水平,为PEDV流行情况及免疫效果评价提供了有效的手段。     

猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法，本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠，按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体，PEDV细胞培养上清为夹心抗原，HRP标记的羊抗猪IgA为二抗，采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法，并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测，结果显示，除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外，其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性，表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测，结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40 960，是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2 560)，表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性...     

猪病毒性腹泻(PED)疫苗免疫后母猪乳汁中PEDV IgA消长动态

为了解猪病毒性腹泻(PED)疫苗免疫后母猪乳汁中IgA抗体消长规律,筛选100头妊娠母猪,平均分为5组(4个试验组和1个对照组),采用"猪流行性腹泻病毒(PEDV)-猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)-猪轮状病毒(PoRV)三联弱毒疫苗"(PTR)和"PEDV-TGEV二联灭活疫苗"(PT)进行不同的免疫。其中,试验Ⅰ组产前40d和产前20d免疫PTR,试验Ⅱ组产前40d和产前20d免疫PT,试验Ⅲ组产前40d免疫PTR和产前20d免疫PT,试验Ⅳ组产前40d免疫PT和产前20d免疫PTR,对照组产前40d和产前20d注射生理盐水。通过PEDV IgA抗体检测试剂盒分别检测母猪分娩后0,1,2,3,5,7,10,14d各组乳汁中特异性PEDV IgA抗体水平。结果显示,试验组IgA水平明显高于对照组,其中试验Ⅰ、Ⅱ组与试验Ⅲ、Ⅳ组间差异极显著(P<0.01),而试验Ⅰ、Ⅱ组间以及试验Ⅲ、Ⅳ组间差异不显著(P<0.05)。结果表明,产前40d和产前20d交替使用PTR和PT的抗体滴度明显优于单一接种PTR或PT的抗体滴度。其中只注射PTR母猪分娩后10d乳汁对仔猪没有保护力,注射PT母猪分娩后7d乳汁对仔猪没有保护力。通过本试验基本上了解了PEDV母源抗体消长规律,为今后规模化猪场制定免疫程序提供理论支持。     

猪流行性腹泻病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。采用建立的ELISA方法检测了130份临床样品,其中78份血清样品为PEDV抗体阳性。表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于检测PEDV感染及相关的流行病学调查。     

PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白阻断ELISA抗体检测方法.本研究将纯化的N蛋白作为包被抗原,通过棋盘滴定法优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV抗体的阻断ELISA方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性试验.对140份临床血清样品进行检测,并将检测结果与市售IDvet PEDV间接ELISA抗体检测...     

抗猪SIgA SC片段单克隆抗体的制备及鉴定

为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000。Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白。抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景。     

猪流行性腹泻病毒血清IgA抗体间接ELISA方法的建立

建立了检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,旨在为PEDV感染检测与免疫效果评价提供技术手段。以重组PEDV结构蛋白(S1蛋白)作为包被抗原,采用方阵滴定法确定抗原包被浓度、封闭液、稀释液以及待测血清和酶标抗体的最佳工作浓度,建立了PEDV IgA抗体检测间接ELISA方法。进而检测方法的特异性、批内与批间重复性,评价建立方法与国外试剂盒的符合率,分析ELISA检测血清特异性IgA抗体水平与中和抗体的相关性。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,封闭液和抗体稀释液为含5%犊牛血清的PBS,待检血清和酶标抗体的工作浓度分别为1∶40与1∶1 500倍稀释。结果表明,该ELISA能够特异地检测PEDV抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等病毒的抗血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数低于10%,与现有试剂盒的总符合率为94.8%,血清特异性IgA抗体水平与中和抗体呈正相关(r=0.69,P<0.001)。     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

本研究获得5个猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1基因截短基因,原核表达后制备多克隆抗体。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、Western blot和间接免疫荧光检测(indirect immunofluorescence assay,IFA)显示,仅有SE蛋白诱导的多克隆抗体具有免疫活性。因此以SE蛋白为抗原建立间接ELISA抗体检测方法,优化各反应参数并确定临界值为0.155。经特异性和符合性分析,该ELISA检测方法具有PEDV特异性,符合率为93.7%。批内、批间重复率变异系数均小于10%,表明建立的iELISA方法重复性良好。抗S蛋白的ELISA检测方法的建立为PEDV血清学抗体检测和疫苗评估奠定了基础。     

猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法的建立

本实验将构建的重组表达质粒pET-32a(+)-S798转入大肠杆菌中诱导表达,获得表达量较高的包涵体蛋白。以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,初步建立了母猪乳汁中IgA抗体的间接ELISA检测方法。抗原包被浓度为0.938ug/mL,乳汁稀释度为1:320,对反应条件进行优化,批内批间重复性试验变异系数均小于10%,与市售试剂盒相比特异性为90%、敏感性为94%、符合率为92%,本方法具有良好的特异性和敏感性,可以对猪乳汁中抗流行性腹泻病毒的IgA抗体水平进行快速检测。     

PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白抗体的ELISA方法,应用RT-PCR从腹泻仔猪样本中扩增获得了1段PEDV河南流行毒株N基因全长序列,根据对其氨基酸序列的抗原性分析结果,将N基因上2个大的抗原表位区(112³21位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32α,构建pET-32α-N重组质粒并转化至宿主菌BL21(DE3)中。将重组菌在37℃条件下加入IPTG进行诱导使该蛋白获得了高效表达,表达产物为融合蛋白,相对分子质量约41 300。Western-blot分析表明,所表达的蛋白可与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清发生反应。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法,抗原最佳包被量0.226μg/孔,血清最佳稀释度为1∶100,二抗最佳稀释度为1∶2 000,待检血清D450值≥0.28判定为阳性。国内首次用该方法对临床猪血清样本进行了检测,母猪血清PEDV抗体阳性率为84.26%(166/197),仔猪血清阳性率为27.93%(31/111)。结果表明,建立的间接ELISA方法特异性、灵敏性和可重复性良好,可用于临床上PEDV抗体水平的监测和PED流行病学调查。     

基于变异PEDV的S-N融合双基因蛋白IgA-ELISA抗体检测方法的建立及应用

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引发猪群腹泻的主要病原之一，给我国生猪养殖业造成了重大的经济损失。为建立IgA-ELISA抗体检测方法，本研究采用变异PEDV真核表达的S-N融合蛋白作为包被抗原，通过系列反应条件优化，建立了PEDV的IgA-ELISA抗体检测方法。该方法的最佳反应条件为包被抗原质量浓度2 mg/L,用5%BSA于37℃封闭2 h;将待检血清1∶50稀释于37℃作用1 h,加1∶20 000稀释酶标二抗于37℃作用30 min, TMB显色10 min;以D_{450 nm} ≥0.326判定为阳性，当D_{450 nm} ≤0.277判定为阴性，介于两者判定为可疑。检测猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(PoRV)标准阳性血清抗体均为阴性，且重复性变异系数均低于10%。通过对我国福建地区304份样品(血清179份和乳汁125份)进行检测，并与商品试剂盒进行参照对比，总符合率达到93.2%以上，表明该试剂盒检测方法具有较高的特异性、敏感性和重复性，可用...