幽门螺旋杆菌lpp20-cagA融合基因在乳酸球菌中的表达及免疫原性研究

为研究载体疫苗对幽门螺旋杆菌(HP)感染的免疫保护作用,本实验应用无缝克隆技术将HP的两个候选抗原基因lpp20和cagA直接连接后克隆于表达载体pNZ8149中,构建重组表达质粒pNZ8149-lpp20-cagA。将重组质粒电转化乳酸球菌(L.lactis)NZ3900,构建了不含任何抗生素筛选标记的食品级原核表达系统pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900,经nisin诱导表达,得到的重组蛋白分子量约为50.3ku。将以上得到的重组L.lactis灌胃免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法分别检测各组小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a及细胞因子IL-4、IFN-γ水平。结果显示,与对照组相比,实验组小鼠血清中IgG、IgG1、IL-4水平显著升高,表明重组蛋白Lpp20-CagA可以诱导良好的体液免疫应答;利用HP攻毒经重组菌灌胃免疫的小鼠,检测小鼠胃组织中HP的定植密度及脲酶活性,结果显示重组蛋白Lpp20-CagA在一定程度上可以减少HP在小鼠胃组织中的定植。本实验构建的载体疫苗在预防HP感染方面具有重要的应用价值。     

口服表达胸腺肽和鸡干扰素融合蛋白的重组乳酸乳球菌对鸡肠道菌群影响的研究

为构建表达胸腺肽和鸡γ干扰素融合蛋白(Tα1-cIFN-γ)的重组乳酸乳球菌并检测其作为口服免疫增强剂对鸡外周血单个核细胞(PBMC)的增殖活性及鸡肠道菌群的影响,本研究将鸡胸腺肽(Tα1)和鸡干扰素(cIFN-γ)的编码基因序列(去除干扰素信号肽编码基因序列),并按照宿主菌乳酸乳球菌NZ3900株的基因组优化密码子后,以经G4S-linker连接的Tα1-cIFN-γ基因为模板,采用PCR扩增携带表达载体p NZ8149同源臂及HA标签的目的基因序列(Tα1-cIFN-γ-HA);通过PCR扩增携带Tα1-cIFN-γ-HA基因序列同源臂的全长p NZ8149载体序列,利用同源重组的方式将这两段基因连接构建重组质粒p NZ8149-Tα1-cIFN-γ-HA,并经PCR和测序鉴定正确后电转化乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中,构建重组乳酸乳球菌p NZ8149-Tα1-cIFN-γ-HA/NZ3900 (r L.lactis-Tα1-cIFN-γ)并经PCR和测序鉴定;将重组乳酸乳球菌r L.lactis-Tα1-cIFN-γ经乳酸链球菌素(Nisin)诱导6 h～7 h,离心超声破...     

PEDV COE基因重组乳酸菌在小鼠体内定植规律研究

选用pNZ8149-COE NZ3900重组乳酸菌作为绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达载体,制成活菌制剂,口服免疫小鼠,以GFP基因作为标记跟踪重组菌在小鼠体内的定位,并利用荧光定量PCR技术对各部位菌定量分析。结果表明,研究构建的重组乳酸乳球菌PEDV-COE-GFP NZ3900可较长时间定植于胃肠黏膜表面,为基因工程重组乳酸菌口服疫苗的研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S1基因在食品级乳酸菌中的表达

猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)纤突蛋白S携带主要的B淋巴细胞抗原表位,是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白,本试验通过PCR扩增,获得TGEV S蛋白上约1 218bp的保护性抗原基因S1,将其克隆到pMD18-T载体并进行核酸序列测定。通过双酶切连接成功获得重组质粒pNZ8149-S1,电转化至乳酸乳球菌NZ3900中,经乳链菌肽诱导,SDS-PAGE和Western-Blot分析结果显示,TGEV S1基因获得了表达,表达产物具有反应原性。间接免疫荧光试验结果表明,重组乳酸菌表达的蛋白位于菌体表面。     

重组羊奇异变形杆菌ompA乳酸乳球菌的构建及其在小鼠体内的定植规律检测

构建了含羊奇异变形杆菌外膜蛋白A(ompA)编码基因的重组载体pNZ8149-ompA,并将其电转入乳酸乳球菌NZ3900中。利用Westen blot检测目的蛋白的表达,流式细胞仪及间接免疫荧光技术检测目的蛋白在乳酸乳球菌中的定位。将重组乳酸乳球菌灌胃BALB/c小鼠,分别于口服后1,2,3,4,5,6,7d取其十二指肠、空肠、回肠、盲肠的肠道冲洗液,通过平板菌落计数法检测乳酸乳球菌在肠道的定植情况。Western blot检测到目的蛋白于49 000处出现特异性条带;流式细胞仪检测到重组乳酸乳球菌表面荧光强度明显强于空质粒对照组;间接免疫荧光试验检测到重组乳酸乳球菌菌体表面出现绿色荧光。灌服小鼠后,重组乳酸乳球菌在小鼠各肠段的定植比例不同,定植能力于口服后6d达到高峰,7d后在重组菌在十二指肠、空肠、回肠和盲肠的定植率分别占第1d的15.23%,24.19%,48.57%,40.07%。本试验证明羊奇异变形杆菌ompA能够稳定表达于乳酸乳球菌表面,且重组乳酸乳球菌在小鼠肠道内具有良好的定植能力,其定植能力为回肠盲肠空肠十二指肠。这为研究乳酸乳球菌作为羊奇异变形杆菌口服疫苗抗原递送载体提供了试验基础。     

表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸菌口服免疫小鼠特异性免疫应答分析

将表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌pNZ8112-Sa/NZ9000经口服免疫BALB/c小鼠,在免疫后的不同时间收集免疫鼠粪便样品,断尾采血收集血液样品并分离血清,用间接ELISA技术检测血清中的IgG抗体及血清和粪便中的IgA抗体的动态产生规律;在加强免疫后流式细胞仪检测分析外周血T细胞的变化情况及无菌收集免疫鼠的肠黏液,经中和试验检测其抗体的中和能力。结果表明重组菌株口服免疫小鼠后血清中的IgG和IgA抗体产生能力由于非特异性干扰不能确定,外周血中T细胞百分数在实验组和对照组间变化不显著;粪便中的IgA抗体水平产生效果明显;黏液的抗体具有一定的中和能力,其效价检测结果为1:36。     

纤维二糖水解酶在乳酸乳球菌中的表达

为在乳酸乳球菌中表达纤维二糖水解酶II(CBH II)基因,对绿色木霉(T.reesei)CBH II基因序列进行密码子优化和合成,通过PCR及T4 DNA连接酶将人工合成的序列插入到表达载体pNZ8148中,获得重组质粒pNZ8148-CBH II,重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后,将正确的重组质粒通过电击转化进入乳酸菌NZ3900感受态细胞,通过选择性抗生素氯霉素筛选阳性克隆,放大培养后使用终浓度为20 ng/mL的Nisin进行诱导表达,诱导后的菌液经SDS-PAGE鉴定,有符合预期大小的条带,说明CBH II基因在乳酸乳球菌NZ3900中表达。研究为乳酸乳球菌的改造及开发临床应用奠定基础。     

表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌的构建及蛋白免疫原性分析

试验旨在构建能表达牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）E2抗原蛋白的重组乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），为进一步研制BVDV乳酸菌口服活载体疫苗奠定基础。将BVDV E2基因克隆后测序，根据乳酸乳球菌的密码子偏嗜性进行优化，再将优化的基因片段插入表达载体pNZ8148中，并电转化乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，构建重组乳酸菌pNZ8148-E2/NZ9000，经1 ng/mL乳链菌肽诱导表达后，对菌体物进行了SDS-PAGE和Western blotting分析。将重组乳酸菌pNZ8148-E2/NZ9000口服免疫6~12月龄健康犊牛，在免疫后不同时间点采集血液样品并分离血清，用间接ELISA方法检测抗体水平。结果显示，PCR扩增到了1 149 bp的目的片段，乳酸菌密码子偏嗜性优化后，GC含量从45.28%变为34.30%。重组质粒pNZ8148-E2经酶切鉴定插入片段与预期大小相符，在菌体裂解物中出现大小约42 ku的条带，与预期蛋白大小一致，且该蛋白可与BVDV E2抗体反应。在免疫犊牛的血清中检测到特异性抗BVDV E2蛋白的抗体。本研究结果表明，表达BVDV E2蛋白的重组乳酸菌口服免疫可诱导犊牛产生特异性的体液免疫反应，该重组菌具有较好的免疫原性。     

CpG ODN联合重组乳酸乳球菌鼻内免疫BALB/c小鼠的佐剂效应

本试验初次建立了CpG ODN联合重组乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型。结果得出CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组血清中抗PRRSV特异性抗体IgG和呼吸道黏膜抗体s-Ig A均高于单独重组菌组(P>0.05)和单独佐剂组(P<0.01),佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组的Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ及黏膜淋巴因子IL-5的活性高于单独抗原组(P>0.05)及单独佐剂组(P<0.01)。试验结果说明CpG ODN作为佐剂与重组菌鼻腔免疫小鼠后,可以提高重组菌诱导的黏膜免疫反应和Th1细胞参与的系统免疫反应,为研究安全有效的重组菌黏膜疫苗奠定了基础。     

不同途径免疫小鼠重组乳酸乳球菌诱导的黏膜及系统免疫应答分析

重组乳酸乳球菌分别经鼻腔和口腔免疫小鼠后,免疫后的测定时间内鼻腔免疫方法刺激呼吸道和肠道产生s-Ig A水平高于口服免疫方法,且肺泡冲洗液中s-Ig A水平差异极显著(P0.01),肠道黏膜s-Ig A水平无显著差异(P0.05);血清中Ig G抗体水平两种免疫方法均无显著差异(P0.05),但鼻腔免疫组抗体水平在最后一次免疫后7 d达到最高,在整个测定时间内维持在高水平,口服免疫组抗体水平在最后一次免疫后21 d达到最高水平,然后迅速下降;h1型细胞因子IL-2和IFN-γ水平滴鼻免疫组高于口服免疫试验组,差异不显著(P0.05),Th2型细胞因子IL-4水平在各组之间差异不显著(P0.05)。结果表明,重组乳酸乳球菌分别经鼻腔及口腔免疫小鼠后,能诱导机体产生黏膜免疫系统的体液免疫及Th1型细胞免疫反应,且滴鼻免疫方法优于口服免疫方法,为传染病的预防控制提供了新的免疫策略。     

表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌在小鼠诱导的免疫应答分析

旨在构建表达猪圆环病毒2型（PCV2）cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri,L.reuteri）,并评价其在小鼠体内诱导的免疫应答效果。利用PCR扩增实验室分离保存的PCV2b型毒株的cap蛋白基因,以猪源L.reuteri为宿主菌,构建表达cap蛋白的重组菌株pPG-T7 g10-PPT-cap/L.reuteri,通过口服免疫BALB/c小鼠。采用间接ELISA方法测定免疫后小鼠血清中抗原特异性IgG抗体水平,粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中抗原特异性sIgA抗体水平,小鼠血清中各细胞因子水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;流式细胞技术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的水平;荧光定量PCR检测免疫后攻毒的小鼠体内器官的病毒载量。结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠粪便、鼻腔洗液、生殖道洗液、肠黏液中sIgA抗体水平显著高于对照组（P<0.01）;小鼠血清中细胞因子水平和对照组相比,IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平升高,IL-10水平降低,IFN-α无显著变化;体外孵育PCV2和小鼠脾淋巴细胞结果表明,重组乳酸菌组小鼠脾淋巴细胞增殖刺激指数显著高于对照组（P<0.01）;流式细胞技术检测结果显示,口服免疫重组乳酸菌组小鼠脾细胞中CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞含量高于对照组;荧光定量PCR结果显示,相比于对照组,口服免疫重组乳酸菌组小鼠体内的病毒载量明显低于对照组。综上所述,本研究成功构建了表达PCV2 cap蛋白的重组罗伊氏乳酸杆菌,经口服途径免疫动物,构建的重组乳酸杆菌能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,且具有一定的免疫保护效果。     

猪IFN-γ和IL-4重组质粒对口蹄疫疫苗的免疫佐剂效应研究

为了研究猪IFN-γ和IL-4对疫苗的免疫佐剂效应,用pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4的重组质粒与口蹄疫双价疫苗配伍免疫小鼠,检测小鼠抗口蹄疫抗体水平和CD4＋/CD8＋T细胞比值的动态变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4重组质粒都能显著提高小鼠抗口蹄疫抗体水平（P〈0.01）,其中pcDNA3.1/IFN-γ提高亚洲Ⅰ型FMD抗体水平的佐剂效应较pcDNA3.1/IL-4的显著（P〈0.01）,而pcDNA3.1/IL-4提高O型FMD抗体水平的佐剂效应显著高于pcDNA3.1/IFN-γ（P〈0.01）,pcDNA3.1也显示出了一定的佐剂效应;免疫后不同时间pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4组CD4＋/CD8＋T细胞比值显著高于其他组（P〈0.01）,且第21天与第7、45天的差异极显著（P〈0.01）。     

新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物调节小鼠DCs成熟对Th1/Th2的免疫增强作用

旨在探讨新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物（ethanol extracts of wild Cistanche deserticola,EEWCD）调节Th1/Th2免疫反应的特点及初步的作用机制。采用卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）为抗原,研究EEWCD对小鼠体液免疫,细胞免疫,细胞因子分泌,树突状细胞（dendritic cells,DCs）的成熟和调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）等的影响。EEWCD低、中、高剂量（分别记作L、M、H）分别与OVA混合,ICR小鼠随机分为0.9% NaCl、EEWCD、OVA、OVA-EEWCD-L、OVA-EEWCD-M、OVA-EEWCD-H和OVA-铝佐剂免疫组。皮下免疫2次,间隔2周。小鼠免疫后,ELISA法检测抗体滴度及分型,MTT检测脾细胞增殖水平,FACS检测CD4⁺ IL-4、CD4⁺IFN-γ和CD8⁺ IFN-γ的水平,以及DCs表面分子与Treg表达水平。结果显示,EEWCD提高了OVA特异性IgG抗体2~3倍;在初次免疫后21 d显著促进IgG₁和IgG_2a的表达水平（P<0.05）;显著促进OVA特异性脾细胞增殖以及T/B细胞的活化（P<0.05）;显著促进CD4⁺ IL-4、CD4⁺ IFN-γ和CD8⁺ IFN-γ的分泌（P<0.05）。同时,EEWCD也显著促进了DCs的CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表达（P<0.05）,下调了Treg的水平（P<0.05）。EEWCD-M为最佳剂量。监测免疫后小鼠行为及体重,小鼠行为没有异常,且同一时间点各组体重之间差异不显著（P>0.05）。综上表明,EEWCD能够促进OVA特异性的Th₁/Th₂免疫反应,尤其促进Th₁型反应,具有良好的免疫调节活性,其作用机制可能为通过激活DCs的成熟,促进IL-4和IFN-γ的分泌,降低Treg的水平调节Th₁/Th₂免疫反应的动态平衡。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定

本试验旨在构建能表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的重组质粒。用疑似患猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪的脾脏、肺脏病料提取RNA,根据PRRSV ORF5基因设计1对引物,进行RT-PCR扩增,将ORF5目的基因克隆到pMD19-T载体中,得到pMD19-ORF5重组菌。根据测序结果和表达载体特点,设计1对带有NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物,扩增目的片段(dORF5),将其分别与pProEXHTb载体、pNZ8149载体连接,得到HTb-dORF5/DE3和pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌,分别用IPTG和Nisin诱导,再进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,HTb-dORF5/DE3重组菌在1.5 mmol/L IPTG诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约22 ku处有特异性条带,且具有反应原性;pNZ8149-dORF5/NZ3900重组菌在20 ng/mL Nisin诱导时表达量最高,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,在约19 ku处有特异性条带,间接免疫荧光试验有特异性绿色荧光。本研究成功构建重组质粒HTb-dORF5和pNZ8149-dORF5并获得表达,这为进一步研制预防PRRS疫苗奠定坚实基础。     

表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定

用疑似患猪流行性腹泻病（PED）的病猪肠病料,根据猪流行性腹泻病毒（PEDV）S糖蛋白基因设计引物进行RT-PCR扩增,获得531bp的PEDV部分保护性抗原基因,将其克隆入pMD18-T载体后测序,核苷酸序列与PEDVCV777株相应序列的同源性为99．4％。根据测序结果和表达载体特点,设计一对引物,扩增PEDV部分保护性抗原基因（COE基因）501bp片段。将COE基因与乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149进行连接,电击转化入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞。重组菌以1ng／mL乳链菌肽（Nisin）诱导,通过SDS-PAGE和Westernblot分析,PEDV部分S蛋白成功表达,并具有反应原性。间接免疫荧光试验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面。     

猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗对仔猪免疫效果的研究

为了评价猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗(Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗)对仔猪的免疫效果,试验将12头仔猪随机分为3组,分别为Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组、重组空载体腺病毒组和PBS对照组,分别于3组仔猪的颈部肌肉注射Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗(浓度为1×10¹⁰ pfu/mL)、空载体重组腺病毒(浓度为1×10¹⁰ pfu/mL)和PBS各2.5 mL,于试验第0,21天分两次免疫。第2次免疫后第14天,麻醉后手术切除仔猪脾脏,采用密度梯度离心法提取猪脾脏淋巴细胞,利用流式细胞仪检测仔猪CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞含量。于第1次免疫前(第0天)及免疫后第7,14,21,28,35,42,49天无菌采集各组试验猪的颈静脉血,分离血清,检测每组仔猪抗猪附红细胞体特异性抗体IgG效价及IgG₁、IgG_2a和细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平,评价Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗对...     

CpG和ICTYOLANETM31佐剂对ASFV-CD2v蛋白免疫效果的影响

探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides, CpG ODN)和ICTYOLANE^TM31微乳佐剂对重组表达的ASFV-CD2v蛋白在小鼠体内免疫效果的影响。以杆状病毒表达的CD2v蛋白为抗原，分别配伍CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide, CPG ODN)和ICTYOLANE^TM31微乳佐剂，皮下免疫BALB/c小鼠。首次免疫后14 d进行二免，采集首免后0、14 d以及二免后7、14及28 d血清，通过间接ELISA检测血清中CD2v抗体水平；采集二免后35 d小鼠分离脾脏淋巴细胞，通过流式细胞术分析IFN-γ水平。结果显示，间接ELISA结果显示在二免后7 d可检测到较高水平的CD2v抗体，ICTYOLANE^TM31佐剂和CPG ODN佐剂组抗体水平明显高于蛋白组。T细胞亚群分析结果显示，在二免后35 d, CpG ODN佐剂组的CD4⁺T淋巴细胞的比例最高，达到81.34%,ICTYOLANE^TM31佐剂组CD8<...     

白细胞介素-10对口蹄疫病毒感染小鼠T细胞增殖及其表达TNF-α、IFN-γ和IL-2的影响

白细胞介素-10(IL-10)增高是口蹄疫病毒(FMDV)感染过程中显著特征之一。本研究旨在探讨IL-10对FMDV感染小鼠外周血T细胞增殖及其表达效应功能相关细胞因子的影响。采用CCK-8和流式细胞术分别检测小鼠外周血T细胞增殖和T细胞表达效应功能相关细胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-2)。结果显示,与对照小鼠相比,FMDV感染小鼠(感染12、24、36和48 h)外周血T细胞对刀豆蛋白A刺激的增殖均显著下降(P<0.05或P<0.01);FMDV感染小鼠的外周血CD4⁺T细胞表达TNF-α和IL-2均显著下降(均P<0.01),CD8⁺T细胞表达TNF-α、IFN-γ和IL-2也显著下降(P<0.01或P<0.000 1)。体内阻断IL-10/IL-10R信号或者敲除IL-10均能显著恢复FMDV感染小鼠外周血T细胞的增殖(P<0.05或P<0.01),但不影响CD4⁺和CD8⁺T细胞表达TNF-α、IFN-γ和IL-2。本研究首次揭示FMDV能抑...     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10⁹ PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

猪脂联素球状结构域gAd基因在乳酸乳球菌中的表达

本研究旨在克隆猪脂联素球状结构域gAd基因,构建重组质粒并将其转化至乳酸乳球菌NZ9000中进行表达,并在体外对重组猪脂联素球状结构域进行生物学活性分析。提取猪脂肪组织总RNA,扩增得到脂联素基因全长并测序,设计引物引入酶切位点和His-tag,把gAd亚克隆到表达载体pNZ8048,将重组质粒转化乳酸乳球菌NZ9000中诱导表达。通过Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白纯化后再Western blotting检测。然后,将gAd蛋白注射到高糖饲喂的小鼠体内鉴定生物学活性。结果表明成功获得了gAd基因并在乳酸乳球菌NZ9000中表达,表达产物相对分子质量约17ku。经纯化后用Western blotting检验具有反应原性,动物试验证明制备的gAd蛋白能显著降低小鼠的血糖水平。本研究为利用外源重组脂联素球状结构域调节猪的脂肪代谢打下了良好的基础。