药用半枫荷基因组总DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

利用正交试验设计方法,对影响ISSR-PCR反应的Mg2＋、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶等因素进行优化的结果表明：在20μL PCR反应体系中含10×PCR Buffer,0.018μmol/L引物,4.0 mmol/L Mg2＋,15 ng/μL模板DNA,1.5 U Taq DNA聚合酶,4种dNTPs各0.15 mmol/L为半枫荷ISSR-PCR最适反应体系。     

鸭梨ISSR-PCR反应体系的初步建立

以沧州泊头市鸭梨为试验材料,对鸭梨ISSR-PCR反应体系中的模板DNA用量、dNTPs浓度、引物浓度以及Taq酶浓度进行了探索,初步建立适合鸭梨ISSR-PCR反应体系为：在20μL反应体系中,含1×Taq PCR Buffer[1.5 mmol/L Mg2＋]0、.15 mmol/L dNTPs、0.40μmol/L引物、40 ng DNA和1 U Taq酶。     

野扁桃ISSR-PCR反应体系的优化

以野扁桃为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的Mg2 、dNTPs、Taq酶、模板DNA、引物等因素进行筛选和优化,确立了适合野扁桃ISSR分析的最佳反应体系:25μL PCR反应体系中包含1×Buffer,2.0 mmol.L-1Mg2 ,160μmol.L-1dNTPs,模板DNA30 ng,Taq聚合酶1 U,引物15 pmol。     

漾濞泡核桃ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以漾濞泡核桃优株为研究对象,研究其ISSR-PCR反应体系中的5个影响因子(模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度)对PCR扩增效果的影响,从而建立起漾濞泡核桃的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明:模板DNA最佳浓度为50 ng/(25μL),Taq聚合酶浓度为0.75U/(25μL),引物浓度为0.7mmol/L,dNTPs浓度为0.20mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,利用该最佳体系对试验中所选取的样本进行扩增反应。建立了适宜于漾濞泡核桃的ISSR-PCR扩增的最佳体系,该体系的建立为利用ISSR分子标记技术对漾濞泡核桃进行种质资源研究奠定了基础。     

适用于厚朴的SRAP反应体系的建立与优化

利用正交试验L16(45),结合单因素试验对厚朴相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记反应体系的5个因素(Mg2+,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA)进行优化试验,结果表明:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为:dNTPsTaq酶模板DNAMg2+引物;筛选出各反应因素的最佳水平,建立厚朴SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.5 U,Mg2+1.8 mmol.L-1,模板DNA100 ng,dNTP 0.24 mmol.L-1,引物0.40μL。试验表明,该体系重复性好、稳定性强。     

刚竹ISSR反应体系的正交优化

采用正交设计的方法,对刚竹ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶、Mg2 、dNTP、模板DNA和引物)4个水平进行优化筛选,建立了刚竹ISSR-PCR反应的最佳体系,即20μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.5 U、Mg2 2.5 mmol.L-1、模板DNA 80 ng、dNTP 0.15 mmol.L-1、引物0.4μmol.L-1;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。     

紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用单因子试验和正交设计2种方法对影响紫椴ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2 ,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平.2种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了紫椴ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.0U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,1×PCR buffer,30 ng模板DNA.在此基础上筛选出14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.     

杉木SSR-PCR体系优化

SSR-PCR反应体系优化是杉木SSR标记研究的基础.利用正交L16 (45)设计实验对杉木SSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA浓度5个因素的4个水平进行优化试验.并在正交直观分析和方差分析的基础上,分别对Mg2+、dNTPs进行单因素确定.获得的最佳反应体系为:在20 μL反应体系中,Mg2浓度为1.0mmol/L,引物浓度为0.25 μμmol/L,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,Taq酶为0.05 U/μL,DNA为30 ng,10×PCR Buffer 2μL,不足部分用双蒸水补齐至20μL.在最佳反应体系的基础上,采用单因素实验确定了引物的最佳退火范围为63～53℃.利用此反应体系对10个F1代杉木材料及其亲本,进行4对SSR标记进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定.说明此体系适合进一步的杉木SSR研究工作.     

润楠ISSR-PCR优化反应体系建立及引物筛选

以润楠基因组总DNA为材料,利用单因素试验设计方法,对影响ISSR-PCR扩增的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Tag DNA聚合酶以及去离子甲酰胺等试验因子进行了优化试验,筛选出16条有效引物并确定了它们的退火温度,并检测了体系的重复性。优化后的反应体系为:20μL PCR反应体积中,10×PCR Buffer 2μL,2.0mmol/L Mg2+1.6μL,0.2 mmol/L dNTPs 2μL,0.4 mmol/L引物0.8μL,0.5U Taq DNA聚合酶0.1μL,40 ng DNA模板1.0μL,1.5%去离子甲酰胺0.3μL,ddH2O 12.2μL。扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,据不同引物的退火温度复性45 s,72℃延伸90 s,反应37个循环,最后在72℃延伸7 min。润楠ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究润楠的遗传多样性奠定了良好的基础。     

赤皮青冈ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立适宜于赤皮青冈ISSR分析的扩增体系,以赤皮青冈叶片基因组DNA为材料,采用单因素和正交设计相结合的方法系统地测试模板DNA、Mg2+、引物、磷酸碱基脱氧核苷(dNTPs)浓度,Taq DNA聚合酶用量和退火温度这6个因素对ISSR-PCR反应结果的影响。综合分析表明:优化后的最佳反应体系为20μL反应总体系中,含20 ng模板DNA,2.5 mmoL/L Mg2+,0.2 mmoL/L dNTPs,1.0 U Taq DNA聚合酶,0.2μmoL/L引物;UBC 808号作引物最佳退火温度为59.3℃。这一优化体系的建立为进一步开展赤皮青冈遗传多样性的ISSR分析奠定了基础。     

红花石蒜ISSR-PCR反应体系的建立

以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2 的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2 、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min.     

海南木莲基因组DNA提取及ISSR反应体系的优化

通过对不同提取方法获得的海南木莲DNA质量进行分析,发现采用预先去杂CTAB法提取的海南木莲DNA比其它方法简便、高效,DNA杂质少,得率高;然后通过单因素实验设计对海南木莲ISSR—PCR反应体系进行优化,确立了适于海南木莲的ISSR反应体系,即20μL反应体系中含40 ng模板DNA、0.15 mmol.L-1dNTPs、0.40μmol.L-1引物、2.5 mmol.L-1Mg2+和1.5 UTaqDNA聚合酶;最后用16个海南木莲样品对优化体系进行检验,结果表明该体系扩增效果稳定,特异性高,可以用于海南木莲分子生物学的进一步研究。     

鹅掌楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为建立鹅掌楸简单序列重复区间扩增ISSR的PCR优化反应体系,以鹅掌楸叶片基因组DNA为材料,系统地测试了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR反应体系的影响。结果表明:优化的PCR反应体系为:20μL总体系中,含30 ng模板DNA,0.3μmol.L-1随机引物,0.2 mmol.L-1dNTPs,1.4 mmol.L-1Mg2+,0.8 UTaqDNA聚合酶;最佳退火温度为60℃;PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃退火45 s,72℃延伸2 min;45个循环;72℃再延伸7 min。     

松属部分种的ISSR-PCR扩增体系优化及鉴别

对松属部分种的ISSR-PCR的反应体系及扩增程序进行优化,并进行种质鉴别.优化的10 μL扩增体系为:Taq酶0.5 U,10×Buffer(Mg2+ free) ,dNTP 0.35 mmol/L,Mg2+ 2.25 mmol/L,20ng DNA ,0.8 μL引物.扩增程序为:94℃预变性7 min,然后进行40个循环:94℃变性30 s,56℃退火45 s,72℃延伸2 min;最后72℃延伸7 min,4℃保温.从100条UBC系列引物中筛选出5条特异性强、稳定性好的引物UBC823、UBC840、UBC841、UBC855、UBC873,扩增的特异性条带可对松属的7个种进行鉴别.     

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2 浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2 1.8 mmol/L、1×Buffer 2 μL、dNTP0.2 mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10 ng/μL.扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性40 s,52℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,共39个循环;72℃完全延伸5 min,4℃保持.该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件.     

漾濞核桃ISSR-PCR反应体系的建立

以漾濞核桃为研究对象,在从其新叶获得高质量基因组DNA的基础上,通过反应体系和反应程序的试验,建立了漾濞核桃ISSR-PCR反应体系:20 uL反应体系中Mg2 的浓度为0.225 mmol/L,引物的浓度为0.5mmol/L,dNTP的浓度为0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶0.6 U,2.0 uL的10×Buffer和1 uL(40 ng)的模板。反应的基本程序为:95℃预变性600 s,94℃变性30 s,50℃退火60 s,72℃链延伸120 s,35次循环后,72℃延伸420 s。针对不同引物对退火温度进行适当调整,可以获得更为理想的电泳结果;并对云南11个漾濞核桃及杂交品种进行扩增,获得稳定、清晰的电泳结果。     

灰毡毛忍冬DNA不同提取方法的比较试验

以灰毡毛忍冬新品种——金翠蕾为试验材料，比较分析了SDS法、CTAB法、改良CTAB法对金银花总DNA提取的效果。结果表明：利用以上3种方法均能提取出完整的金银花基因组DNA，而DNA提取量从大到小依次为SDS法、改良CTAB法、CTAB法，DNA纯度依次为CTAB法、改良CTAB法、SDS法。CTAB法是灰毡毛忍冬DNA提取的适宜方法。     

狗牙根ISSR—PCR反应体系的建立与优化

以改良的CTAB法提取的狗牙根叶片DNA为模板,采用单因素多水平方法对狗牙根ISSR反应体系进行构建和优化,系统分析Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物和buffer这6种1SSR反应成分的浓度对扩增结果的影响,结果表明:20.0μL PCR反应体积中,20.0 ng模板DNA,0.4 μmol/L引物,0.5mmol/L Mg2+,0.05mmol/L dNTPs,0.2U TaqDNA聚合酶,2.0 μL 10×buffer.反应程序为;94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55 C退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;再72℃延伸7 min,4℃保温.     

南方红豆杉种源遗传多样性和遗传分化

利用ISSR分子标记对来自10省区15个南方红豆杉代表性种源,研究揭示其种源遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等.结果表明:南方红豆杉具有丰富的遗传多样性,物种水平上的遗传多样性为0.419 2,多态百分率(PPL)、Nei's基因多样性(HE)和Shannon信息多样性指数(I)分别变化在80.00%～93.33%、0.339 3～O.3873、O.492 6～O.5615.南方红豆杉种源遗传多样性受其产地经度和纬度非线性共同影响,偏南和偏西地区种源的遗传多样性较低,而偏东和偏北地区种源遗传多样性则较高.因试验的南方红豆杉种源其原产地种群皆是较大的古树群,且片断化的时间较短,加上其特有的繁育特性,种源问基因分化系数为O.1211,仅有8.75%的遗传变异存在于种源间,而91.25%的遗传变异来自于种源内.UPMGA聚类结果还显示,除福建武平和武夷山2个较小种群的种源外,试验种源可按地域大致划分为偏东和偏北,及偏南和偏西2个种源区.