桉树ISSR-PCR反应体系的建立及优化

模板DNA、引物、dNTPs、Mg^2＋的浓度,Taq DNA聚合酶的用量以及退火温度是影响简单序列重复区间扩增（ISSR-PCR）结果的主要因素.以桉树叶片基因组DNA为试材,系统地测试了这6个因素对桉树ISSR反应结果的影响.结果表明：最优化的反应体系即20μL反应体系中,含20 ng模板DNA、0.4μmol.L^-1随机引物、0.15 mmol.L^-1dNTPs、2.0 mmol.L^-1Mg^2＋、1.25 U TaqDNA聚合酶.最佳退火温度为55℃;PCR反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;72℃再延伸7 min.     

鹅掌楸Genomic-SSR反应体系优化

The optimization of the Genomic-SSR reaction system is a basic protocol when the Genomic-SSR is used for genetic analysis in Liriodendron. The concentrations of Mg²⁺, dNTP, Primer and rTaq were tested by L₉(3⁴) orthogonal experiment and single factor gradient experiment to gain the optimal reaction system. The results indicated that the optimal reaction system should contain 75 ng of genomic DNA, 1 μL of 10×buffer, 0.4 μL of 10 mmol·L^-1 dNTP, 0.75 μL of 2.5 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.25μL of 10 μmol·L^-1 Primer, 0.05 μL of 5 U rTaq and final volume of 10μL. Repeated trials and two verification tests showed that this optimal reaction system was stable, reliable, efficient and suitable for the applications of Genomic-SSR in Liriodendron population genetics and quantitative genetics research.     

墨兰ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立墨兰的ISSR-PCR反应体系,采用正交试验分析了5个因素（Tag酶浓度、Mg2＋浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度）在4个水平上对 ISSR -PCR反应的影响。结果表明：Tag 酶浓度为1.6U/25μL、Mg2＋浓度为2.4mmol/L、dNTP浓度0.96 mmol/L、Primer浓度为0.64μmol/L、DNA 浓度3.2ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。     

南酸枣ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以南酸枣叶片基因组DNA为模板,采用单因子实验方法对影响ISSR反应体系的dNTP、Mg2+、引物浓度、模板DNA、Taq酶等5个因子进行优化,结果表明,在20 L ISSR反应体系中,各反应物的最适含量为：2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、0.25～0.5 mol/L引物、20 ng DNA和0.5 U Taq聚合酶。利用该优化体系扩增85条ISSR引物,有65条有扩增产物,38条具有多态性,并且利用842引物扩增不同南酸枣DNA模板,扩增的目的条带清晰、多态性好、稳定性强,可以用于后期的南酸枣种质资源鉴定及遗传多样性研究。     

红花石蒜 ISSR-PCR反应体系的建立

以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2 的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2 、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min.     

澳洲坚果ISSR-PCR反应体系的建立与优化

澳洲坚果(Macadamia spp.)属山龙眼科(Proteaceae)澳洲坚果属(Macadamia)常绿乔木.原产于澳大利亚昆士兰州东南部和新南威尔士州北部、南纬25°-31°之间的沿海亚热带雨林.     

润楠ISSR-PCR优化反应体系建立及引物筛选

以润楠基因组总DNA为材料,利用单因素试验设计方法,对影响ISSR-PCR扩增的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Tag DNA聚合酶以及去离子甲酰胺等试验因子进行了优化试验,筛选出16条有效引物并确定了它们的退火温度,并检测了体系的重复性。优化后的反应体系为:20μL PCR反应体积中,10×PCR Buffer 2μL,2.0mmol/L Mg2+1.6μL,0.2 mmol/L dNTPs 2μL,0.4 mmol/L引物0.8μL,0.5U Taq DNA聚合酶0.1μL,40 ng DNA模板1.0μL,1.5%去离子甲酰胺0.3μL,ddH2O 12.2μL。扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,据不同引物的退火温度复性45 s,72℃延伸90 s,反应37个循环,最后在72℃延伸7 min。润楠ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究润楠的遗传多样性奠定了良好的基础。     

药用半枫荷基因组总DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

利用正交试验设计方法,对影响ISSR-PCR反应的Mg2＋、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶等因素进行优化的结果表明：在20μL PCR反应体系中含10×PCR Buffer,0.018μmol/L引物,4.0 mmol/L Mg2＋,15 ng/μL模板DNA,1.5 U Taq DNA聚合酶,4种dNTPs各0.15 mmol/L为半枫荷ISSR-PCR最适反应体系。     

南方红豆杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以南方红豆杉DNA为模板,采用正交试验设计对影响南方红豆杉ISSR-PCR扩增的参数进行了优化。结果表明较佳的南方红豆杉ISSR-PCR的反应体系(20μL)为模板DNA 60 ng,10×PCR buffer 2.0μL,25 mmol/L的MgCl21.0μL,2.5 mmol/L的dNTPs 1.0μL,10μmol/L的引物1.0μL和反应酶0.2 U。适宜的扩增条件为94℃预变性4 min,41个PCR循环(94℃变性30 s,54.5℃退火45 s),72℃延伸80 s,72℃延伸5 min,4℃保存。     

漾濞泡核桃ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以漾濞泡核桃优株为研究对象,研究其ISSR-PCR反应体系中的5个影响因子(模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度)对PCR扩增效果的影响,从而建立起漾濞泡核桃的最佳ISSR-PCR反应体系。结果表明:模板DNA最佳浓度为50 ng/(25μL),Taq聚合酶浓度为0.75U/(25μL),引物浓度为0.7mmol/L,dNTPs浓度为0.20mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,利用该最佳体系对试验中所选取的样本进行扩增反应。建立了适宜于漾濞泡核桃的ISSR-PCR扩增的最佳体系,该体系的建立为利用ISSR分子标记技术对漾濞泡核桃进行种质资源研究奠定了基础。     

钩栗ISSR-PCR反应体系的建立与优化

本研究以钩栗叶片为实验材料,采用单因素和L16(45)正交实验探讨了DNA模板用量、Mg2+浓度、引物用量、Taq DNA聚合酶、d NTP用量以及不同退火温度对钩栗ISSR-PCR扩增的影响,建立了钩栗ISSR-PCR反应体系。研究结果显示,优化后的最佳反应体系为,20μL反应总体系中,含30 ng模板DNA,3 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L d NTPs,0.75 U Taq DNA聚合酶,0.3μmol/L引物;对钩栗DNA样品材料进行ISSR-PCR扩增体系的检测结果显示,该优化体系扩增的产物条带清晰,稳定性高,本研究为钩栗种质ISSR分子标记遗传结构分析提供技术基础。     

紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用单因子试验和正交设计2种方法对影响紫椴ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2 ,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平.2种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了紫椴ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.0U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,1×PCR buffer,30 ng模板DNA.在此基础上筛选出14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.     

狗牙根ISSR—PCR反应体系的建立与优化

以改良的CTAB法提取的狗牙根叶片DNA为模板,采用单因素多水平方法对狗牙根ISSR反应体系进行构建和优化,系统分析Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物和buffer这6种1SSR反应成分的浓度对扩增结果的影响,结果表明:20.0μL PCR反应体积中,20.0 ng模板DNA,0.4 μmol/L引物,0.5mmol/L Mg2+,0.05mmol/L dNTPs,0.2U TaqDNA聚合酶,2.0 μL 10×buffer.反应程序为;94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55 C退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;再72℃延伸7 min,4℃保温.     

细叶桉ISSR-PCR体系的建立与优化

细叶桉是我国近年来成功引种的耐寒桉树种类之一,但其种源关系难以区分,不利于后续新品种的培育.为给后续的分子水平上鉴定细叶桉种源关系打基础,以细叶桉叶片基因组DNA为材料.分析了能够影响细叶桉ISSR-PCR的主要参数如模板DNA、引物浓度、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度等6个因素对扩增结果的影响情况,建立了适用于细叶桉ISSR-PCR的反应体系和扩增条件.     

漾濞核桃ISSR-PCR反应体系的建立

以漾濞核桃为研究对象,在从其新叶获得高质量基因组DNA的基础上,通过反应体系和反应程序的试验,建立了漾濞核桃ISSR-PCR反应体系:20 uL反应体系中Mg2 的浓度为0.225 mmol/L,引物的浓度为0.5mmol/L,dNTP的浓度为0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶0.6 U,2.0 uL的10×Buffer和1 uL(40 ng)的模板。反应的基本程序为:95℃预变性600 s,94℃变性30 s,50℃退火60 s,72℃链延伸120 s,35次循环后,72℃延伸420 s。针对不同引物对退火温度进行适当调整,可以获得更为理想的电泳结果;并对云南11个漾濞核桃及杂交品种进行扩增,获得稳定、清晰的电泳结果。     

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2 浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2 1.8 mmol/L、1×Buffer 2 μL、dNTP0.2 mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10 ng/μL.扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性40 s,52℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,共39个循环;72℃完全延伸5 min,4℃保持.该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件.     

贯叶金丝桃ISSR反应体系的建立与优化

以药用植物贯叶金丝桃为研究对象,对其ISSR—PCR反应体系中模板DNA用量、Mg2＋浓度、dNTP浓度、Taq酶含量及退火温度等因素进行了梯度试验,得到最佳ISSR—PCR反应体系,并初步筛选出13条条带清晰、多态性高、重复性好的ISSR引物,为贯叶金丝桃遗传多样性及种质资源鉴定等方面的研究奠定基础。