农杆菌介导主要农作物遗传转化的研究进展

在植物基因工程中,农杆菌介导的遗传转化是比较完善和相对高效的转化方法,但在单子叶植物中应用相对较少。本文对水稻、玉米、小麦等三种重要禾本科植物农杆菌转化法的应用进行了介绍,重点综述了影响转化效率的因素及农杆菌转化法在功能基因组学研究及商业方面的应用进展。     

纤维素酶基因（BGLI、CBHⅡ）与DREBIA基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHCl7、pCD29A质粒为基础，分别构建了玉米泛蛋白（Ubi）启动子调控的纤维素酶基因（BGLI、CBHII）与rd29A启动子调控的DREBlA基因的双价植物表达载体pBDB，pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因（BAR），该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，为利用农杆菌介导法进行BGLI，CBHlI和DREBlA基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将 DREB1A基因导入植物奠定基础     

参与农杆菌侵染及T-DNA转运过程植物蛋白的研究进展和思考

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤病原细菌,携带具有天然转基因功能的Ti质粒或Ri质粒,能将一部分遗传物质插入到寄主植物的染色体上,使其稳定遗传和表达,赋予植物新的性状。所以农杆菌作为最有效的转化媒介,已被广泛应用于多数双子叶植物和部分单子叶植物转基因研究。虽然农杆菌介导的转化技术具有操作简单、成本低廉,转基因沉默几率小,插入基因拷贝数少等优点,但农杆菌介导植物遗传转化是一个复杂的生物学过程,需要一系列农杆菌蛋白和植物蛋白相互作用,共同完成外源基因的转入和整合。植物相关蛋白在转化过程中起着重要作用。其中,阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)、植物根钙粘附蛋白和类玻连蛋白等参与农杆菌附着于植物细胞表面的过程;鸟苷三磷酸腺苷酶（GTPase）和BTI蛋白协助T-DNA和Vir效应蛋白进入植物细胞;actin、GIP、VIP等蛋白参与T-DNA复合体在细胞质中的运输的过程;与Vir效应蛋白互作的VIP1、VIP2、KAPa、PP2C、Roc等蛋白协助T-DNA定位于植物细胞核;组蛋白、VIP1和VIP2等引导T-DNA在植物基因组上的整合。由于植物种类间存在巨大差异,上述一些植物蛋白基因的过表达虽能提高农杆菌转化某些植物的转化效率,但不能提高另一些植物的转化效率。在容易被农杆菌遗传转化的植物如拟南芥、水稻中的研究表明,VIP1、VIP2、AGP、H2A等蛋白与农杆菌转化关系密切,但这些蛋白在利用农杆菌转化较难的作物如小麦、玉米中的功能还不明确,因而需要在不同植物中继续筛选和鉴定与T-DNA转化相关重要蛋白的编码基因。目前,农杆菌介导的植物遗传转化有2个显著特点,一是农杆菌介导转化烟草、拟南芥、水稻等模式植物的技术日渐成熟,二是农杆菌介导转化小麦、玉米、大豆等重要作物的技术仍然没有本质突破,植物相关蛋白在T-DNA转运、整合等过程中的作用还需要深入研究和进一步明确。文章主要对参与农杆菌介导遗传转化植物整个过程中相关植物蛋白的研究进展进行了综述,以期为提高农杆菌转化顽拗型作物的转化效率提供参考。     

超声波辅助农杆菌介导法转化鱼腥草的初步研究

应用超声波直接转化法、农杆菌介导转化法、恒定频率的超声波仪处理植物15 min后再用农杆菌介导法侵染植物和在农杆菌侵染过程中辅助以超声波处理10 s 4种方法对鱼腥草进行转基因研究,结果显示:上述4种转化法对gus基因最大瞬时表达率依次为47%、60%、80%和75%。结论:用恒定频率的超声波仪处理植物15 min后再用农杆菌介导法侵染植物和在农杆菌侵染过程中辅助以超声波处理10 s两种转化法gus基因的瞬时表达率最高,说明超声波辅助农杆菌介导遗传转化方法是一种高效的鱼腥草转基因方法,它实现了外源基因在植物中的高效表达。     

农杆菌T-DNA介导的桑树遗传转化研究进展

农杆菌介导外源基因是目前研究最多,应用最广的植物转基因方法。本文对农杆菌介导的植物遗传转化机理,以及T-DNA介导在植物基因组中的加工、转移、整合的分子机理和桑树遗传转化的近几年研究进行了综述,并对桑树基因工程进行了展望。     

植物基因转化方法及在果树上的应用

本文综述了近年来植物基因转化的方法，各种方法在实际应用中的局限性及在果树基因转化方面取得的进展。植物基因转化方法包括及农杆菌介导法和直接转化法。果树基因转化研究已在１０余个树种中取得成功，其中大多数采用杆菌介导转化法。     

根瘤农杆菌二组分体VirA/VirG介导的侵染性

根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是存在于土壤中的革兰氏阴性菌，可以侵染很多种双子叶植物、单子叶植物以及裸子植物的受伤部位，用位于其Ti质粒上vir基因产物来诱导植物产生冠瘿瘤，因此，根瘤农杆菌广泛用于植物基因工程研究，是个农业工程菌。研究表明vir基因的表达受VirA/VirG二组分体的介导。回顾和总结了根瘤农杆菌的VirA/VirG二组分体的结构、作用机理、以及所感知的环境因子，和这些环境因子通过VirA/VirG二组分体对vir基因的表达调控分子机制。     

玉米Ubiquitin启动子的克隆及功能鉴定

根据Cornejo发表的Ubiquitin启动子的序列,设计引物从玉米自交系18红中克隆出该启动子,测序证明与发表的序列具有98%的同源性,并构建了带有该启动子和GUS基因的植物表达载体,将重组质粒导入农杆菌LBA4404,用农杆菌介导法转入烟草和小麦愈伤中,通过GUS染色反应,证明克隆的启动子在单子叶和双子叶植物中均有活性。     

植物afp表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化

详细报道了胡萝卜抗冻蛋白基因 (afp)植物表达载体的构建过程及其直接法转化农杆菌的方法。以限制性内切酶从克隆载体上切取 afp基因 ,将其连接在相应酶切的 p BI12 1工程质粒上 ,构建成 afp植物表达载体。采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌 ,并用 PCR方法进行了鉴定     

带有GFP标签的油松苯丙氨酸解氨酶基因表达载体的构建

利用基因重组技术,将油松的苯丙氨酸解氨酶基因（TaPAL）克隆到PBI121植物表达载体中,并且用报告基因GFP替换了GUS,构建了包含绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物重组表达载体PBI121-GFP-TaPAL,GFP标签比GUS基因更加易于检测,方便进行TaPAL功能鉴定方面的研究。利用电击法将重组表达载体成功的转化进农杆菌GV3301中。该研究可以为深入研究苯丙氨酸解氨酶的结构及功能及进一步通过导入次生代谢关键酶来提高植物的抗病育种提供基础。     

利用农杆菌介导法获得RNAi转基因枫香的研究

随着我国林业生态工程和退耕还林的开展，木材生产与需求之间的矛盾愈加严重，培育速生优质大径材的研究更加重要。基于LEAFY基因在植物生长发育中的特性，利用PCR和Gateway技术构建了含有LEAFY基因保守序列的RNA干涉植物表达载体LFY-RI，利用根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciems介导法获得转基因植株，利用RNA干涉技术抑制转基因植株中LEAFY基因的表达，从而获得枫香Liquidambar formosana不育转基因植株。并利用聚合酶链式反应（PCR）技术和PCR-Southern杂交技术检测了转基因植株中外源基因整合情况。共获得了5株枫香转基因植株，分子检测表明，其中4株为转基因阳性植株。由于转基因植株还比较幼嫩，对它们生长发育以及木材品质的变化尚处于在观察中。图5参12     

小黑杨抗虫基因的遗传转化

建立了小黑杨转基因受体系统,利用农杆茵介导法将蜘蛛神经毒肽与bt基因C末端肽组成的融合基因导入小黑杨中,获得了3个小黑杨转抗虫基因植株,转化子为A1、A2、A3,并对其进行了GUS活性及目的基因PCR检测。初步证明A1、A2、A3为转基因阳性植株。     

CYcD2基因转入丽格海棠研究

[目的]改变丽格海棠的开花时间,为丽格海棠分子育种奠定基础。[方法]以丽格海棠叶片为外植体,利用液氮直接转化法将pBI121-CYcD2转入根癌农杆菌EHA52中,再通过农杆菌介导法将CYcD2基因导入丽格海棠中。[结果]选择100 mg/L的卡那霉素作为转化外植体的起始选择压力。将经农杆菌共培养及过渡培养后的材料转入筛选培养基中,60 d后获得15个不定芽,再在生根培养基中培养20 d后,全部生根。PCR检测发现,15株卡那霉素抗性植株中有6株表现出与阳性对照相同的特异性条带,剩余植株为假转化体。Southern杂交分析表明6个转化植株中有5个出现了杂交信号,即为转基因植株,仅有1个为假阳性。[结论]该研究已成功地将外源基因CYcD2转入丽格海棠受体中。     

转基因杨树中农杆菌残存状况分析

以转发根农杆菌741杨为材料,在继代和移栽过程中对其残存农杆菌进行追踪检测。结果表明:培养基中附加头孢噻钨纳300 mg/L可将农杆菌基本抑制;随着转化植株在含抗生素培养基中继代时间的延长,残存农杆菌的数量和活性逐步下降,在继代18个月后,无法培养出目的菌落,但转化植株一旦脱离抗生素环境,农杆菌数量和活性又将得到恢复;残存农杆菌主要分布于植株体表和茎中,且影响组培苗PCR检测结果;将转化株系组培苗移栽到花盆半月和田间6个月后,植株体表、体内均未检测到目的农杆菌,但在室内培养半个月后2个株系根际土壤中检测到目的菌落。     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

PTLF基因RNAi结构转化毛白杨的研究

[目的]PTLF是杨树花发育的重要基因,可抑制杨树开花,解决杨树飞絮散粉污染环境的问题,并降低生殖生长对营养生长的竞争。[方法]利用农杆菌介导的叶盘转化法将含PTLF基因的RNAi（RNAinterference）载体35S-PTLF-IR转化毛白杨。[结果]通过聚合酶链式反应（PCR）检测,初步验证10株阳性转化植株。[结论]对转基因毛白杨和野生型毛白杨组培苗进行高生长分析表明,前者生长速度、株高低于后者。     

番茄生长素应答因子ARF1基因RNA干涉载体的构建及其对番茄的转化

将番茄生长素应答因子家族成员之一ARF1中的500bp左右的特异片段导入到植物载体pBI121中,构建成RNAi表达载体(pBI121-ARF1),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养和抗性筛选获得再生植株.PCR检测再生植株,初步鉴定为阳性植株,为后续进一步鉴定该基因功能奠定了基础.     

番茄cry1基因果实特异性植物表达-载体的构建及其转化番茄的研究

隐花色素(cryptochrome)是一类对UV-A/蓝光作出应答的光受体.果实特异性植物表达载体是用在番茄果实中特异表达的Lefsm1基因的启动子(fsp)替换质粒pBI121原有的35S启动子构建而成(称为pBI121 fsp).将番茄隐花色素家族成员之一cryptochrome1中465 bp特异片段导入到植物栽体pBI121 fsp构建成果实特异性表达的RNAi植物表达载体(pBlI21fsp-cryI),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.为后续对CRY1与番茄果实中抗氧化剂番茄红素之间的关系研究提供了材料.