苏云金芽胞杆菌cry1Aa19基因的克隆、表达及杀虫活性分析

研究根据cry1Aa类基因的全长序列设计全长引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株LS-R-21的基因组DNA为模板扩增出片段大小为3 600 bp的cry1Aa的全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pEB相连接获得含有cry1Aa全长基因的重组质粒pEB-cry1Aa,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,诱导表达出132 ku的蛋白。该蛋白由1 175个氨基酸组成,其分子质量为132.9964 ku。该基因核苷酸序列已在GenBank中登录,登录号为HQ685121,并且被国际基因命名委员会正式命名为cry1Aa19。杀虫活性测定结果表明,cry1Aa对小菜蛾(Plutella xylostella)有很强的杀虫活性,LC50为1.18μg.mL-1。该基因的获得将为害虫抗性研究及高效工程菌的构建提供了重要的试验材料。     

十株Bt野生菌杀虫晶体蛋白及基因型分析

利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE蛋白分析方法,分析了从我国千山地区不同森林地带土壤中分离的10株Bt菌的32类杀虫晶体蛋白基因类型和表达蛋白。研究表明,电镜照片显示晶体形状较为多样,有长菱形、菱形、方形、球形。同时含有cry1、cry7、cry16类基因的有1株菌,同时含有cry1、cry2类基因的有1株菌,含有cry30类基因的有1株菌,含有cry1基因的有3株菌,4株菌不含所鉴定的32类基因。同时也发现,绝大多数含有cry1基因的菌株表达了130ku蛋白,含有cry2基因的菌株表达了60ku的蛋白,含有cry30基因的菌株表达了30ku的蛋白。     

苏云金芽胞杆菌BRC-HZP7杀虫晶体蛋白多样性分析

分离自武夷山土壤的苏云金芽胞杆菌BRC-HZP7菌株对小菜蛾和甜菜夜蛾幼虫有较好的毒杀作用.对该菌株进行了生理生化测定、cry基因的PCR-RFLP检测,以及通过SDS-PAGE检测晶体蛋白,并对蛋白点进行肽段指纹图谱鉴定.结果表明该菌株含有cry1Aa、cry1 Ba、cry1 Ia、cry2Ab、cry2Ac、cr...     

基于cry1Ac表达调控元件的苏云金芽孢杆菌表达载体构建

通过克隆cry1Ac基因BtI-BtII启动子、SD序列以及终止子,并引入pET28a的His标签和多克隆位点,在穿梭载体pHT304的基础上构建了一个苏云金芽孢杆菌表达载体pBMB1A。将cry1Ac以及具有非典型BtI-BtII启动子的cry2Ab、cry5Ba、cry6Aa、cry7Ba、cry55Aa 6个基因装载到该表达载体上,转入BMB171构建了重组菌株,通过复红简单染色后的显微镜镜检结果表明,重组菌株BMB1A-1Ac、BMB1A-5Ba、BMB1A-7Ba和BMB1A-55Aa均能形成正常晶体,SDS-PAGE结果也证实这4个重组菌株的重组质粒均能表达出目的蛋白。同时,选取重组菌株BMB1A-1Ac来考察His标签对Cry1Ac杀虫活性的影响,生物活性测定结果显示重组菌株的LC50值与对照菌株相比无明显差异。该载体可用于快速克隆表达不同类别的Cry蛋白。     

产Zwittermicin A的苏云金芽孢杆菌菌株的筛选及抗性基因zmaR的克隆与表达

 通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌，其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌（Erwinia herbicola）的抑菌活性，结果表明有67株菌有抑菌活性，其中21株抑菌活性较高。经鉴定，抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因，并从G03中克隆了zmaR全长基因，完成了序列测定。该基因编码区为1 125 bp，由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个，分子量为43.5 kD，等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21，可正常表达43.5 kD蛋白，并使宿主菌产生对Zwittermicin A的抗性。     

对甜菜夜蛾高毒力Bt新菌株的PCR-RFLP分析及生物活性测定

利用PCR-RFLP对Bt.新菌株cyz-13,T4-3的基因型进行分析。结果表明,cyz-13含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Bc,cry2Ab4种基因型,其中cyz-13菌株的PCR产物的酶切片断类型不同于已知的基因类型;T4-3菌株含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Ag,cry2Ac,cry1Ia5种基因型。室内生测结果显示,两菌株对甜菜夜蛾、粘虫、棉铃虫、玉米螟均具有高毒力,好于H D-1标准菌株。两菌株的发酵液均有杀虫活性,二者上清的杀虫因子不同。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达

【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5 kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS-PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170 ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。     

PCR-RFLP筛选DNA文库克隆Bt cry基因的研究

 Bt菌株C0 0 2对水稻二化螟、甜菜夜蛾具有高毒力 ,PCR RFLP鉴定含有cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知杀虫蛋白基因cryX等 ,其中cry1Ca位于染色体DNA 6～ 9kb的EcoRI片段。染色体和质粒DNA分别经EcoRI完全酶切和Sau3AI部分酶切、电泳回收 6～ 9kb片段。E .coli Bt穿梭载体pHT315分别与目的DNA连接、转化大肠杆菌感受态细胞后获得了相应的DNA文库。约 5 0个转化子合为一个转化子池 ,采用PCR RFLP方法快速检测 ,分别从约 2 0 0 0质粒DNA文库转化子和 4 0 0个染色体文库转化子中筛选获得了cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知基因cryX的阳性克隆 ,相应命名为pHT 1Aa、pHT 1Ca、pHT 2Ab和pHT X。限制酶切分析表明 ,含有cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab基因的克隆片段均含有相应基因的保守物理图谱。进一步将这些质粒分别导入Bt无晶体突变株CryB-,SDS PAGE分析表明 ,只有cry1Ca表达了约 130ku杀虫晶体蛋白。初步杀虫生测结果显示 ,cry1Ca对甜菜夜蛾具有高毒力 ,7d校正死亡率为 10 0 %。     

cry1Ac基因启动子表达Vip3Aa蛋白特性分析

苏云金芽胞杆菌cry基因启动子常用于构建蛋白表达载体。为探讨苏云金芽胞杆菌cry基因启动子指导Vip3Aa蛋白表达情况及杀虫活性,以p UC19载体为基础,运用重叠引物PCR方法构建Vip3Aa11表达载体,并与由T7启动子指导的Vip3Aa11表达蛋白杀虫活性、抗胰蛋白酶稳定性比较,初步探索发酵条件。结果表明,cry1Ac启动子与T7启动子均在上清液中表达大小为88 ku Vip3Aa11蛋白,对甜菜夜蛾、棉铃虫杀虫活性差异不显著,cry1Ac基因启动子在37℃、48 h更适合Vip3Aa11蛋白的表达,为vip基因表达、功能验证及杀虫机理等研究提供新思路。     

苏云金杆菌新菌株WB9 cry1基因型的PCR-RFLP分析

利用 PCR- RFLP技术对 Bt新菌株 WB9的 cry1基因型进行分析 ,结果表明该菌株含有 cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和 cry1Ga 5种 cry1基因型 ,且 cry1Ab的酶切产物不同于正常的 cry1Ab.采用特异引物对 G1/ G2扩增 ,也证明 WB9含有 cry1Ab基因 .在此基础上 ,再利用引物对 G1/ K3un2进行扩增 ,其产物经回收纯化后用 Eco R / Xba 双酶切分析 ,结果也表明 WB9所含的 cry1Ab与众不同 ,无大片段出现且有一条 4 0 0 - 5 0 0 bp的特异片段     

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L.）NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

Cloning of Bt cry Genes by Rapid Screening of DNA Libraries with PCR-RFLP

Bacillus thuringiensis (Bt) strain C002 contains crylAa, cry2Ab, cry1Ca insecticidal crystal genes and an unkown gene cryX, among which crylCa is located in a 6 -9 kb EcoR Ⅰ fragment of the chromosomal DNA. The total DNA and the plasmids DNA libraries of C002 were constructed in Bt-E. coli shuttle plasmid pHT315 by inserting 6 - 9 kb chromosomal and plasmid DNA fragments prepared respectively with EcoR Ⅰ complete and Sau3A Ⅰ partial digestion. On the basis of every 50 transformants pooled together from 5 - 10 tubes, the pools containing about 2 000 transformants from the plasmids DNA library and 400 transformants from the total DNA library were rapidly screened by PCR-RFLP. Clones containing crylAa, cryX, crylCa, and cry2Ab were isolated and named as pHT-1Aa, pHT-X, pHT-1Ca and pHT-2Ab respectively. Restriction analysis indicated that pHT-1Aa, pHT-1Ca and pHT-2Ab had the typical physical map of the homologous cry genes. Furthermore, each plasmid was transferred into Bt acrystalliferous strain cryB- by eletroporation. SDS-PAGE result showed that transformant of pHT-1Ca expressed 130 kDa protein and bioassay result proved its high toxicity against Spodotera exigua 1st instar larvae with 100% corrected motality.     

cry2Aa9m抗虫基因植物表达载体构建及对大豆的遗传转化

cry2Aa9m基因编码的杀虫晶体蛋白(ICPs)对鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Dipter)昆虫具有显著的毒杀作用,可防治大豆食心虫等害虫。试验构建了由豆荚特异性启动子Pmsg调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A,以抗除草剂bar基因为筛选标记,通过农杆菌介导法对绥农28大豆子叶节进行遗传转化,获得抗性株系8株。经PCR和RT-PCR检测结果证明,cry2Aa9m基因已经整合到大豆基因组中并得以表达。研究为抗大豆食心虫转基因育种产业化奠定基础。