RT-PCR法分离伊氏锥虫VSG基因的研究

应用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法分离伊锥虫安微株克隆虫体ＳｈＴａｔｌ的二信抗原变异体ＳｈＴａｔ１．３和ＳｈＴａｔ１．５总ＲＮＡ，在含有甲醛物琼脂糖凝胶电泳后，转印到硝酸纤维膜上。根据布氏锥虫ＶＳＧｍＲＮＡ３’端保守序列，设计合成了一个互补于它的含十八个碱基的寡核苷酸５’－－ＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧ－３’，经＾３２Ｐ标记，Ｎｏｔｒｈｅｒｎ杂交，首次证明２伊氏锥虫含有同样的保守序列。利用合成的十     

同一克隆两个不同变异体的伊氏锥虫在兔体内抗原变异研究

为了解伊氏锥虫在兔体内感染后期抗原变异的情况及较同一克隆不同变异体锥虫在兔体内抗原变异情况,用伊氏锥虫安徽株单虫克隆ＳｈＴａｔ１．２感染兔,在兔体３０天中每隔３天及感染后５１、５４、５７天（兔５８天死亡）分离兔血中锥虫并克隆,获得１３个克隆锥虫群体,经间接免疫荧光试验和ＡＢＣ酶标记试验鉴定为１０个抗原性互不相同的抗原变异体（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｙｐｅ,ＶＡＴ）,其中早期（感染锥虫３     

克隆伊氏锥虫不同VAT的某些生物学特性研究

对伊氏锥虫安徽株单虫克隆ＳｈＴａｔｌ感染兔体后３、６、９和１８ｄ所分离的４个抗原变异体ＳｈＴａｔｌ．１、ＳｈＴａｔｌ．２、ＳｈＴａｔｌ．３和ＳｈＴａｔｌ．５的生长特征、对人血清敏感性和对小白鼠致病力三个方面进行了比较研究。结果表明不同抗原变异体的生物学特性不完全一致,它提示伊氏锥虫的抗原变异可能伴有虫体其它生理生化特性的改变。     

传染性法氏囊病病毒变异株主要免疫原基因cDNA的克隆及鉴定

采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从１株传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）本地分离株ＧＺ９０２中扩增到编码ＩＢＤＶ主要免疫蛋白ＶＰ２的ｃＤＮＡ片断，大小约为１３５０ｂｐ。将该ｃＤＮＡ片断插入ｐＢｓＫ质粒中，用重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，成功获得重组质粒转化菌。对重组质粒ＤＮＡ进行酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片断与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相符。对ＧＺ９０２高可变区进行了序列分析。其核苷酸序列与３株ＩＢ－ＤＶ变异株Ａ、ＧＬＳ、Ｅ的同源性分别达到９８．９％，９６．２％和９５．５％。而与其他Ⅰ型毒株的同源性较低。比较从ＤＮＡ序列推导出的氨基酸序列，发现ＧＺ９０２高可变区的两个亲水区均发生了一个氨基酸的变化，而在２４９和２５４位上的氨基酸分别为Ｋ和Ｓ，与以上３个变异株相同，但与所有标准Ⅰ型毒株不同。这两个氨基酸可以作为ＩＢＤＶ变异株的标志。     

鸡减蛋综合征病毒分离株AA－2基因组Hind Ⅲ酶切部分片段的分子克隆

以非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ），经差速离心法纯化，电镜下观察到病毒无囊膜，大小为７０～８５ｎｍ。以蛋白酶Ｋ法抽提病毒基因组，琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量约３４ｋｂ、背景清晰的核酸带。ＨｉｎｄⅢ酶切ＥＤＳＶＤＮＡ可见１０条片段，以ｐＵＣ１９质粒为载体，采用鸟枪法对病毒基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段进行分子克隆，获得１７个重组质粒，通过酶切、斑点杂交鉴定，证实已经成功地克隆到ＥＤＳＶ的５．２４ｋｂ、２．０２ｋｂ、１．６５ｋｂ、１．４７ｋｂ、１．４１ｋｂ等５个ＤＮＡ片段。     

混合保护液和冻前处理方法对小鼠胚胎一步冷冻效果的影响

选用Ａ￣Ｅ５种混合保护液：Ａ．二甲亚砜（ＤＭＳＯ）＋乙醇（ＥＧ），Ｂ．甘油（ＧＬ）＋丙二醇（ＰＧ），Ｃ．ＧＬ＋ＥＧ，Ｄ．ＧＬ＋ＤＭＳＯ，Ｅ．ＰＧ＋ＥＦ，以２种冻前处理方法，对小鼠桑椹胚和囊胚进行一步冷冻，冷冻混合保护液中各种保护剂浓度均为２５％。法的冻前平衡液为ＶＳ２的对倍稀释液；法的冻前平衡液中，前一种保护剂浓度为１０％，后一种保护剂浓度为２０％。胚胎于室温（２０℃）下在ＶＳ１中平衡５ｍｉｎ或Ｖ     

影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素

试验对影响玻璃化冷冻兔胚胎效果的一些因素进行探讨，以找出理想的玻璃化冷冻方法。在测试的５种玻璃化溶液中，含３５％乙二醇（ＥＧ）和１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的溶液（ＶＳ１）对胚胎的毒性最小。用ＶＳ１冷冻桑椹胚和囊胚的理想程序是：在室温下使胚胎分别在２０％ＥＧ和３５％ＥＧ中平衡２、３分钟后，移入ＶＳ１中，０．５分钟内（囊胚也可在２分钟后）投入液氮中冷冻。桑椹胚的存活率为９１．７％（３３／３６），囊胚的存活率为９７．１％（３３／３４）～９７．３％（３６／３７）。８～１６细胞胚胎的理想冷冻程序为：在室温下使胚胎在２０％ＥＧ、３５％ＥＧ中平衡２、３分钟，移入４℃的３７％ＥＧ＋１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中平衡２分或１０分钟后冷冻，胚胎存活率分别为１００％（３７／３７）、８６．１％（３１／３６）。     

卵黄免疫球蛋白IgY的提纯及应用研究进展

１IgY的性质鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）是鸡卵黄中存在的主要免疫球蛋白，当用某种抗原免疫母鸡时，母鸡产生免疫反应，在卵黄成熟期，血液中的免疫球蛋白IgG选择性的转移到卵黄中，称卵黄免疫球蛋白IgY，IgY在子鸡孵育过程中和孵育后对子鸡起保护作用。IgY的性质与哺乳动物的IgG类似，其分子量约１８０kDa，由两条轻链和两条重链组成（２H＋２L），其中轻链（L）分子量约２２０００Da，重链分子量约６７０００Da，等电点接近５．２。含氮量为１４．８％。IgY的氨基酸组成与鸡血清IgG和牛IgG不同（如表１）。持良好。根据MakotoSh…     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达

将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。     

VP_7-ELISA检测牛、羊血清蓝舌病抗体的研究Ⅱ应用VP_7-ELISA检测蓝舌病抗体

蓝舌病ＶＰ７抗原包被板在－２０℃保存期为６个月,４℃保存１个月。抗原批内重复性试验ＣＶ＜１０％,批间重复性试验ＣＶ＜１０％。ＶＰ７－ＥＬＩＳＡ与ＡＧＩＤ对４２０份血清平行检测结果：ＶＰ７－ＥＬＩＳＡ较ＡＧＩＤ试验多检出了 １３份阳性样品, ＶＰ,－ＥＬＩＳＡ检出的阳性样品对ＡＧＩＤ阳性样品的覆盖率为９７．４％,对采自陕西等省１８１６份牛、羊血清样品进行检测,检出阳性样品数为２５７份阳性检出率为１４．２％。     

伊氏锥虫在小鼠体内抗原变异规律及免疫保护试验

为了探索伊氏锥虫抗原的变异规律及其用于免疫预防的可能性，首先对伊氏锥虫安微株单虫克隆2个早期变异体ShTatl.1、ShTat1.2采用蛋白酶抑制剂TLCK处理，分离纯化这2种变异体的VSG，用ShTat1.1 VSG免疫KM小鼠，ShTat1.1锥虫攻击免疫鼠后6d分离锥虫，经间接免疫荧光试验（IFT）和班点酶标记试验（Dot-EIA)鉴定为ShTat1.2，说明同一克隆锥虫感染兔，小鼠第1次发生抗原变异后产生的变异体相同。依据这一规律，设计了免疫预防保护试验，试验小鼠分3组：一组为未免疫对照组，一组为ShTat1.1VSG单一抗原免疫组，另一组为ShTat1.1 VSG,ShTat1.2 VSG混合免疫抗原免疫组，各组均以ShTat1.1锥虫攻击，结果ShTat1.1 VSG ShTat1.2VSG免疫组小鼠全部获得保护，单用ShTat1.1 VSG免疫组小鼠和未免疫小鼠血中全部出虫、死亡，前者比后者出虫时间、存活时间延长。提示运用伊氏锥虫抗原变异这一规律设计的这种复合抗原，能激发宿主克服虫体抗原变异对免疫保护的干扰。     

伊氏锥虫单虫克隆的2个变异体的VSG的交叉免疫保护试验

为了考察同一克隆锥虫的不同变异体的可变糖蛋白分子 (VSG)有无交叉免疫作用 ,首先采用蛋白酶抑制剂TLCK处理 ,分离纯化伊氏锥虫安徽株单虫克隆 2个早期变异体ShTat1 1、ShTat1 2的VSG ,然后采用这 2种VSG进行交叉免疫保护试验。试验鼠分为对照组 ,ShTat1 1VSG免疫组 ,ShTat1 2VSG免疫组。用弗氏佐剂按常规进行 3次免疫注射 ,每次抗原用量均为 50 μg/只。三免后第 1 2天 ,将各组小白鼠随机分为 2个小组 ,分别用ShTat1 1、ShTat1 2攻击 ,每只攻虫 1 50 0条。结果攻虫后的对照鼠及异源攻虫后的免疫鼠尾血最早出虫时间均为攻虫后第 3天 ;同源锥虫攻击后免疫鼠的尾血最早出虫时间为第 6天。对照组经攻虫 ,保护率均为 0 /8;免疫鼠经交叉攻虫 ,保护率均为 0 /8;VSG免疫鼠用同源锥虫攻击 ,保护率分别为 5/1 0和 3/1 0。表明各VSG激发的免疫只能抗同源锥虫的感染 ,对异源锥虫感染无保护力     

运用伊氏锥虫抗原变异规律进行免疫的初步研究

为了克服锥虫抗原变异对宿主免疫反应的干扰，探索伊氏锥虫病高效保护性抗原，根据伊氏锥虫在宿主体内第一次发生变异产生的变异抗原免疫原性相同的规律，设计了伊氏锥虫变异前抗原（VSG1）和第二次变异所产生的抗原（VSG2）复合物作免疫原，对小鼠进行免疫与单用变异前抗原免疫鼠相比较，两组鼠都用带变异前抗原的虫攻击，另以未免疫的鼠作对照，结果VSG1＋VSG2免疫组小鼠8只全部获得保护，单用VSG1免疫组小鼠10只和未免疫组小鼠10只血中全部出虫而死亡，前者比后者出虫时间和存活时间延长，提示运用伊氏锥虫抗原变异这一规律设计的这种免疫复合物，能激收缩主克服虫体抗原变异对免疫保护的干扰。     

PCR amplification of RoTat 1.2 VSG gene in Trypanosoma evansi isolates in Kenya

A direct card agglutination test for Trypanosoma evansi, CATT/T. evansi based on the predominant variable antigen-type (pVAT) RoTat 1.2 was evaluated previously in the field in Isiolo District, Kenya. Sixteen out of 51 (31.4%) parasitologically positive camels were negative by the antibody detection test. In the present study, trypanosomes isolated from the camels were analysed in an attempt to determine the cause of the false negative results of CATT/T. evansi. A total of 20 field isolates comprised 16 stocks from camels that were negative by CATT/T. evansi, and 4 from CATT/T. evansi-positive camels. In addition, 15 known T. evansi and four T. brucei were used as reference. Purified DNA samples were tested using an established RoTat 1.2-based polymerase chain reaction (PCR) that yields a 488 bp product for the specific detection of T. evansi. Antibodies to RoTat 1.2 variant surface glycoprotein (VSG) were used in Western blotting to detect RoTat 1.2 VSG linear epitopes. Results of PCR and Western blot showed that the 16 stocks isolated from CATT/T. evansi-negative camels fell into three groups. In Group 1, both the RoTat 1.2 VSG gene and the VSG were absent in three stocks. In five trypanosome stocks in Group 2, the RoTat 1.2 VSG gene was detected, but Western blot was negative indicating absence of the expressed VSG. Five other stocks containing the RoTat 1.2 VSG gene were also in this group. The RoTat 1.2 VSG gene was detected and Western blot was positive in all four trypanosome stocks in Group 3. All four stocks from CATT/T. evansi-positive camels contained the RoTat 1.2 VSG gene and the expressed VSG. The reference T. evansi KETRI 2479 lacked the RoTat 1.2 VSG gene and there was no immune reactivity detected by Western blot. The rest of the reference T. evansi stocks examined contained the RoTat 1.2 VSG gene. All the four T. brucei samples examined were negative by PCR and Western blot. In conclusion, this study showed that the RoTat 1.2 VSG gene was absent from some T. evansi trypanosomes in Kenya.     

Expressed truncated N-terminal variable surface glycoprotein (VSG) of Trypanosoma evansi in E. coli exhibits immuno-reactivity

The variant surface glycoprotein (VSG) of trypanosome is an important part of its body surface coat, which is expressed in early, middle and late stages of infection contributing a major diagnostic value. In the present study, the 5' end of the partial VSG gene sequences (681 bp) encoding N-terminal protein of RoTat 1.2 VSG (227 amino acid) was amplified, cloned into pET32a vector, and expressed in prokaryotic system. The fused His-tagged expressed VSG protein (43 kDa) of the Trypanosoma evansi was characterized in SDS-PAGE and immunoblotting using hyperimmune/immune sera raised against buffalo, dog, lion and leopard isolates of T. evansi. The expressed protein remained immunoreactive with all the sera combinations. The animals immunized with whole cell lysate or recombinant protein showed similar antibody reactions in ELISA and CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis). This study suggests the expressed recombinant truncated VSG is having its importance for its possible use in sero-diagnosis of surra.     

伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

A double antibody sandwich ELISA for detection of Trypanosoma evansi variant surface glucoprotein (VSG) antigen was established by using two monoclonal antibodies against Trypanosoma evansi VSG antigen.The result of sensitivity showed when positive serum was diluted to 3200 doubles, its D_{450 nm} value was still greater than the critical value of positive and negative,and specificity test result showed that there was no cross reaction with the antigens of Theileria,Toxoplasma gondii,Chlamydia and Fasciola gigantica.82 clinical sera were detected by this double antibody sandwich ELISA and its positive rate was 9.76%.The experiment results demonstrated that this double antibody sandwich ELISA for detection of Trypanosoma evansi VSG antigen had good detecting sensitivity and specificity,and could be used as an effective method for clinical detecting buffalo Trypanosoma evansi disease.     

水牛伊氏锥虫病免疫胶体金试纸条的研制及初步应用

为建立一种快速、简便、适应现场应用的水牛伊氏锥虫病诊断方法,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗伊氏锥虫VSG抗原的OB6单克隆抗体,在硝酸纤维素膜上包被纯化的抗伊氏锥虫VSG抗原的TB7单克隆抗体和兔抗小鼠IgG,作为检测带和质控带,然后优化条件,研制成检测伊氏锥虫病的免疫胶体金试纸条.通过交叉试验表明该试纸条与衣原体、弓形虫、旋毛虫、巴贝斯焦虫和大片吸虫无交叉反应.该试纸条最低可以检出1∶3 200倍稀释的伊氏锥虫VSG抗原(浓度为3.11 mg·mL-1).应用该试纸条对230份水牛血清样本进行初步检测,同时用ELISA做平行试验,阳性符合率为88.2％.结果证明该试纸条是一种快速、灵敏、特异的水牛伊氏锥虫病的检测方法,为水牛伊氏锥虫病的现场检测诊断和预控提供了有效的方法.     

伊氏锥虫同工酶、蛋白质和抗原组分的比较研究

本文采用生化技术对八个中国伊氏锥虫株及一个布氏锥虫株的同工酶、蛋白质和抗原组分进行比较研究。根据同工酶电泳结果,可将伊氏锥虫和与其形态上不能区分的布氏锥虫区别开来,亦可将伊氏锥虫分为两个酶株群(Z1、Z2)。根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和免疫印迹试验的结果,可将酶株群Z1分成五个不同多肽群(株)。本研究结果表明,中国伊氏锥虫遗传变异程度较低,是一个相对稳定的种群。     

伊氏锥虫和媾疫锥虫蛋白组分的电泳分析

应用SDS—PAGE和IEF电泳对伊氏锥虫和媾疫锥虫的蛋白组分进行了分析.在SDS—PAGE中,伊氏锥虫有21条带.媾疫锥虫有19条带,两种虫体的蛋白质区带在分子量40000～90000之间存在差异,尤其表现在表面糖蛋白上,伊氏锥虫为43000,媾疫锥虫为60000.在IEF电泳中,伊氏锥虫出现26条带,媾疫锥虫出现33条带,两种虫体的蛋白质区带在等电点4.8～5.6之间相同,而在5.6～7.0之间存在差异.本实验还对马媾疫锥虫的蛋白质进行了双相电泳分析,显示出86个多肽斑点.