牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、AP2主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定

利用DNAStar Protean功能筛选AP1和AP2主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、AP2主要抗原域基因,PCR扩增串联体基因片段,将其克隆至pET-30a(+)载体,转化BL21(DM3)细胞,进行高效表达,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。PCR扩增出320bp的AP1和759bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 065bp的AP1、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经诱导能够可溶性表达,目的蛋白相对分子质量大小约46 000,纯化后重组蛋白的纯度96%,Western blot分析重组融合蛋白结果表明,能够被兔源抗无乳链球菌阳性血清所识别。重叠延伸PCR获得了AP1、AP2主要抗原域串联体,构建了pET-30a(+)/AP1+AP2重组表达载体,诱导目的蛋白呈可溶性表达,表达产物具有良好的免疫反应原性,为进一步研究基于AP1、AP2蛋白的致病机制,检测制剂及疫苗奠定了试验基础。     

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿亚基不同组合融合抗原对BALB/c小鼠免疫保护性实验

为评价牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿亚基不同组合融合蛋白AP1-AP2、 AP1-BP、 BP-AP2、AP1-BP-AP2对BALB/c小鼠的免疫保护性,本研究取各融合蛋白与同体积的弗氏佐剂进行乳化,分别制备融合抗原免疫制剂,4种免疫制剂均以50μg/只对小鼠进行4次免疫后均产生了较高滴度的抗体,其中AP1-BP-AP2融合抗原产生的抗体滴度水平最高,可达1∶25 600。在免疫后第50 d时利用104 cfu/mL乳腺炎无乳链球菌攻毒,每天观察记录小鼠的精神状态、食量变化等生理状态。攻毒试验结果显示,4种不同融合抗原均显示不同程度的免疫保护性,其中AP1-BP-AP2融合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护性为最佳,其免疫保护指数PI达到80%。本研究首次创新性地开展牛乳腺炎无乳链球菌Ia亚型PI-2a菌毛岛屿AP1、AP2、BP亚单位不同组合抗原对BALB/c小鼠的免疫保护试验,获得了AP1-BP-AP2融合抗原的免疫保护效果为最佳的结论,为进一步开发无乳链球菌性乳腺炎防控的亚单位疫苗及其流行病学检测试剂盒提供了实验依据。     

奶牛乳腺炎无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因主要抗原区域的融合表达及抗原性鉴定

为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk及纤连蛋白FbsA三重活性的多亚单位融合蛋白,研究其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性,根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因的核苷酸序列,利用DNAStar软件对蛋白的抗原表位序列进行分析并设计合成包括重叠PCR引物共4对引物,通过重叠PCR技术将前2个基因主要抗原区域进行拼接后插入pET30a(+)载体,再将第3个基因插入。为减少三重基因串联表达过程中3个蛋白之间空间构象的干扰,在3个基因连接处各引入1段45bp的柔性linker,结果重组基因在BL21感受态中实现了可溶性表达,表达的蛋白约62 000;Western blot试验表明多亚单位融合蛋白可被无乳链球菌多抗识别,且由此融合蛋白制备小鼠多抗能够识别sip、pgk及FbsA等3个蛋白;这表明构建的多亚单位融合蛋白可能具备sip、pgk及FbsA蛋白的三重活性,而且在小鼠的攻毒保护性试验中,重组多亚单位融合抗原对攻毒小鼠的保护优于单个蛋白。本试验为牛无乳链球菌性乳腺炎新型疫苗的研究提供了一定的参考数据。     

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿rAP1-BP-AP2重组蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立了奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体的间接ELISA检测方法。优化后抗原的最佳包被量为5.0μg/孔,血清样品最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶5 000。对S.agalactiae、S.pyogens、E.coli、S.aureus、S.epidermidis阳性血清进行检测结果显示,后4种阳性对照血清未出现阳性反应,表明该方法具有良好的特异性;对已知牛无乳链球菌阳性血清倍比稀释后进行检测时,当稀释倍数达到1:12 800时仍出现阳性结果,表明该方法具有较高的敏感度;重复性试验显示批内变异系数为2.41%~8.89%,批间试验变异系数为7.53%~10.46%;用该方法对426份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,结果显示,其样品阳性检出率为45.07%。本研究首次基于乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿三联重组蛋白建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种准确、可靠的检测方法。     

奶牛乳腺炎无乳链球菌sip与pgk双基因主要抗原区域的融合表达

为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk双重活性的融合蛋白,探讨其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性。根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk基因的核苷酸序列,设计合成4条引物,通过重叠PCR技术将2个基因主要抗原区域进行融合表达;在2个基因连接处引入45bp连接肽的核苷酸序列;重组蛋白通过pET30a(+)载体及BL21表达菌实现原核表达,表达的蛋白大小约为47 000;Western blot检测表明,重组蛋白可被无乳链球菌多抗识别,具有较好地免疫生物学活性。本研究为奶牛乳腺炎无乳链球菌亚单位疫苗的研发提供了一定的理论依据。     

DENND1B蛋白对AP2B1蛋白细胞中表达及分布影响的研究

为探究含DENN结构域蛋白1B (DENND1B)对网格蛋白依赖性内吞接头蛋白复合体(AP-2)的β亚基(AP2B1)的影响,本实验利用si RNA干扰技术以及慢病毒包装过表达系统改变DENND1B蛋白的表达水平,通过荧光定量PCR(qPCR)、western blot以及激光共聚焦技术研究DENND1B蛋白对AP2B1蛋白的表达以及细胞内定位的影响。结果显示:DENND1B蛋白沉默后能够下调AP2B1蛋白的表达,而过表达DENND1B后能够上调AP2B1蛋白的表达,并且干扰DENND1B蛋白表达后能够显著性地改变AP2B1在细胞内的定位(p0.05),使AP2B1蛋白由核周聚集改变为胞质弥散分布。上述结果表明DENND1B蛋白能够调控AP2B1蛋白的表达以及细胞定位。本实验为研究接头蛋白以及网格蛋白依赖性的质膜内吞途径提供了新的切入点。     

AP2M1在狂犬病病毒侵入中的作用研究

本研究前期利用RNA干扰技术在人类全基因组水平上筛选到了与狂犬病病毒(RABV)生命周期有关的宿主基因AP2M1。为进一步研究AP2M1影响RABV感染的机制,本实验在人胚胎肾细胞(HEK-293)中沉默或过表达AP2M1,采用高内涵筛选、病毒滴度检测等方法分析AP2M1对RABV感染率的影响。结果显示:敲低AP2M1,RABV感染率显著下降;过表达AP2M1,RABV感染率上升。酸绕过实验显示AP2M1在RABV感染过程中发挥作用。激光共聚焦观察显示RABV G蛋白与AP2M1无共定位。免疫共沉淀实验显示AP2M1与RABV G蛋白无直接相互作用。本研究结果表明,AP2M1基因在RABV感染过程中发挥作用,但不是通过与RABV G蛋白的直接作用影响病毒的感染。本研究为阐明AP2M1在RABV生命周期中具体作用奠定了基础。     

牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白pgk抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为评价牛乳腺炎无乳链球菌重组表面蛋白(pgk)免疫原性,并通过建立检测抗体的间接ELISA方法对免疫抗体效价进行评价,本研究根据GenBank登录的无乳链球菌pgk基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板PCR扩增出pgk蛋白抗原优势区的编码基因序列。将其插入pET-30a(+)中,并在大肠杆菌中表达。Western blot鉴定表明,表达的重组蛋白与阳性血清具有良好的反应原性。采用纯化的表达产物作为包被抗原建立了检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.115μg/mL,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶4 000。初步应用于检测无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌小鼠阳性血清的检测。结果表明牛乳腺炎无乳链球菌pgk亚单位抗原具有良好的抗原性,抗体检测灵敏度达到1∶4 000,同时表现良好的特异性。     

牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为测定牛源无乳链球菌表面免疫相关蛋白(sip)的抗原性,本实验通过建立间接ELISA方法,对该蛋白的抗原性进行分析及鉴定.根据无乳链球菌sip基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板,PCR扩增sip抗原表位优势区编码的基因序列,并将其与原核表达载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒pET-sip,转化宿主茵BL21中,经IPTG诱导,获得重组蛋白,western blot分析表明,重组蛋白具有良好的抗原性.以纯化的表达产物作为包被抗原,建立检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.125μg/mL,血清最佳稀释度为1:160,酶标二抗最适稀释度为1:4000.应用该方法对无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌兔阳性血清进行检测,结果表明,该方法具有良好的特异性和灵敏度.     

链球菌GapC蛋白的表达及其多克隆抗血清的制备

本研究对乳房链球菌GapC蛋白基因进行了克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性试验。应用PCR技术直接从临床分离的乳房链球菌菌株基因组中扩增出GapC蛋白基因,并将其克隆至pET28a（＋）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）中表达。经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的乳房链球菌GapC基因序列AF421900的同源性为99．8％。氨基酸同源性为100％;与GenBank发表的无乳链球菌GapC基因序列AF421899的同源性为91．4％;与停乳链球菌GapC基因序列AF375662的同源性为88．9％。表达的融合蛋白通过MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒纯化,纯化蛋白免疫小鼠3次,制备GapC抗血清。本研究表达和纯化了乳房链球菌GapC蛋白,并制备出鼠抗血清,为下一步开展GapC重组蛋白的应用研究莫定了基础。     

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌rSip-PGK-FbsA融合蛋白的间接ELISA检测方法的建立

为建立一种快速而准确的奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的无乳链球菌的膜表面相关蛋白SIP、磷酸甘油激酶PGK及纤连蛋白FbsA 3种串联表达的融合蛋白rSip-PGK-FbsA为包被抗原,建立了检测奶牛无乳链球菌抗体的间接ELISA方法。该方法与化脓性链球菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、金黄色葡萄球菌阳性血清、表皮葡萄球菌阳性血清均无交叉反应,特异性良好;阳性血清稀释至1颐12 800仍检测为阳性,具有较高的敏感性;批内和批间试验变异系数均小于10%,重复性好。利用该方法与以SIP、PGK单一蛋白建立的ELISA方法对160份已知样品进行检测,结果显示,该方法的阳性符合率达到98.6%,高于SIP、PGK单一蛋白建立的ELISA方法的阳性符合率。对389份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,其阳性检出率为46.53%。本研究建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种更加准确、可靠的血清学方法。     

停乳链球菌GapC_(1-150aa)蛋白单克隆抗体的制备及其线性表位鉴定

链球菌Gap C蛋白是表达于各种链球菌的膜蛋白,具有良好的免疫原性。为研制预防链球菌感染的表位疫苗和研发以单克隆抗体(MAb)为基础的检测试剂盒,本研究利用表达的停乳链球菌Gap C蛋白aa1~aa150片段制备了3株MAbs,并利用噬菌体展示技术对这3株MAbs的抗原表位进行分析,获得一个线性表位137HDILDG142。该研究不仅有助于了解链球菌Gap C的免疫保护作用机制,也有助于进一步研究表位疫苗和建立检测方法。     

IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌保护性抗原Sip亚单位疫苗的研究

为研究无乳链球菌Fc-Sip亚单位疫苗的免疫效果,并验证IgGFcRn在奶牛乳腺发生局部免疫过程中的重要作用。本研究采用大肠杆菌原核表达系统,表达了由IgGFcRn介导无乳链球菌保护性表面抗原蛋白(Sip)的融合蛋白Fc-Sip,并与佐剂混合制成Fc-Sip亚单位疫苗。选取干奶前15 d的奶牛进行加州乳房炎检测法(CMT)检测,选取120头CMT(++)以上的奶牛进行分组免疫。通过免疫前后的细菌分离试验、牛奶体细胞数测定、免疫牛血清抗体间接ELISA检测来评价该亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前乳样细菌分菌率为86.6%,无乳链球菌检出率为46.6%;免疫后乳样分菌率降至40%,无乳链球菌检出率降至13.3%,表明Fc-Sip亚单位疫苗不但可以治疗无乳链球菌性奶牛乳房炎,还可以抑制其它奶牛乳房炎致病菌的侵入。首次免疫后60 d,免疫组80%奶牛血清抗体滴度达到1∶2 048～1∶4 096,对照组奶牛抗体滴度一直保持在1∶512。首次免疫后90 d,使用利拉伐牛奶体细胞计数仪测定实验奶牛乳样中的体细胞数,免疫组奶牛乳样体细胞数范围在0.17×10~5个/mL～3.91×10~5个/mL,对照组奶牛乳样体细胞数的范围在4.05×10~5个/mL～7.27×10~5个/mL。免疫组奶牛血清抗体滴度的升高及免疫后牛奶中体细胞数的减少,表明该亚单位疫苗促进了奶牛体液免疫反应和局部免疫反应的发生,也证明该亚单位疫苗具有降低牛奶体细胞数的作用。本研究为奶牛乳房炎无乳链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

停乳链球菌MIG基因的克隆和原核表达

本研究用PCR方法从停乳链球菌C588的基因组DNA中扩增出MIG基因，用T／A克隆法将其插入pBS—T载体，并构建原核表达载体pET-32a（＋）-MIG。用BL21（DE3）／pET系统表达Trix—MIG融合蛋白，SDS—PAGE和Westem blot分析鉴定表达产物。结果PCR扩增产物经测序，证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因（AF354651）序列同源性为99％。SDS—PAGE显示，经IPTG诱导后BL21（DE3）／pET-32a（＋）-MIG总蛋白中出现一条相对分子质量为89ku的新蛋白条带。Westem blot分析显示，MIG蛋白可与停乳链球菌多克隆抗血清发生特异性反应。MIG融合蛋白的表达为MIG在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

牛乳腺炎无乳链球菌Pgk基因抗原优势区原核表达产物的抗原性分析

为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。     

罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体ELISA检测方法的建立及对疫苗免疫效果的评估

为建立检测罗非鱼无乳链球菌特异性抗体的方法及评价疫苗的免疫效果,本研究首先制备纯化罗非鱼无乳链球菌特异性IgM和兔抗罗非鱼无乳链球菌IgM的IgG,利用原核表达纯化的无乳链球菌ScpB蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立检测无乳链球菌特异性IgM抗体的ELISA方法,并通过比较测定无乳链球菌疫苗免疫后血清抗体水平变化与攻毒后相对免疫保护率的关系来评估该方法的有效性。结果表明:该方法仅能够特异性的检测罗非鱼的血清抗体,而与其它鱼类的血清抗体无交叉反应,特异性良好,其敏感性为1∶800,批内、批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性,并且抗体水平的变化与相对免疫保护率(RPS)变化具有平行相关性,变化趋势基本一致。本研究首次建立了检测罗非鱼无乳链球菌特异性IgM抗体的ELISA方法,该方法可以作为评估无乳链球菌疫苗免疫效果的有效手段,也为罗非鱼无乳链球菌病的检测提供技术支撑。     

3种奶牛乳房炎链球菌的gapC基因原核表达及其免疫原性研究

为研究引起奶牛乳房炎的病原菌停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因工程疫苗及其生物免疫活性,试验采用PCR方法扩增出停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因cDNA序列,克隆到pMD18-T载体上,将重组质粒pMD18-T-TRgapC、pMD18-T-WRgapC和pMD18-T-RFgapC经双酶切鉴定、测序及序列分析后,再将gapC基因亚克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,构建停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因原核表达质粒pET-28-TRgapC、pET-28-WRgapC和pET-28-RFgapC;将构建好的原核表达质粒转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳、纯化、复性后经Western blot检测,得到了约38 ku的条带,与预期大小相符。说明这3种蛋白有一定的免疫原性。     

无乳链球菌表面蛋白Rib基因克隆与重组表达

无乳链球菌是引起奶牛乳房炎的常见病原微生物之一,其表面蛋白作为一种高免疫原性的生物大分子,具有较高的种内特异性,是理想的候选疫苗与免疫检测靶标。本研究通过对无乳链球菌高免疫原性表面蛋白Rib的重组表达与抗体制备,为后期无乳链球菌的疫苗研制与检测奠定了良好的基础。首先提取了无乳链球菌基因组DNA,从中成功扩增出长度为452bp的编码表面蛋白Rib N端的基因片段。将这一片段连入重组表达载体pET-26b,转化受体菌株BL21(DE3)后利用IPTG进行诱导,结果表达了分子质量约为18ku的外源蛋白。在低温表达条件下,对IPTG诱导浓度进行优化,结果表明,IPTG的最适诱导浓度为0.05mmol/L。将诱导后的菌体进行超声波破碎并进行SDS-PAGE检测,结果显示重组蛋白以包涵体形式存在,对其进行变性、复性处理,利用亲和凝胶纯化后获得了纯度较高的重组蛋白。将重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,经检测抗体效价达到1∶480 000。     

猪细环病毒2型衣壳蛋白的原核表达及纯化

本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。     

罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白的表达及IgM抗体间接ELISA方法的建立

为了建立一种具有良好特异性、敏感性、重复性和准确性的,能够检测罗非鱼源无乳链球菌的ELISA方法,试验首先进行了罗非鱼源无乳链球菌ScpB基因的克隆及其蛋白的表达和纯化,然后以重组蛋白作为包被抗原、罗非鱼待测血清作为一抗、抗罗非鱼IgM单克隆抗体2C10作为二抗、羊抗鼠IgG-HRP作为三抗建立间接ELISA方法并对该方法进行条件(抗原包被质量浓度、一抗稀释度、抗原包被条件、封闭液、一抗作用时间、二抗作用时间)优化,最后确定该方法的临界值并进行特异性、敏感性、重复性和符合性试验。结果表明：纯化后的罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白大小为104.6 ku,与预期大小一致,可被罗非鱼IgM抗体特异性识别;建立的IgM抗体间接ELISA方法的最佳抗原包被质量浓度为0.1μg/mL,最佳一抗稀释度为1∶5,最佳抗原包被条件为4℃、12 h,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳一抗作用时间为2 h,最佳二抗作用时间为0.5 h;临界值上限为0.456,临界值下限为0.377;批内变异系数为3.349%～5.272%,批间变异系数为2.793%～5.902%,均低于10.000%;仅可检测出罗非鱼无乳链球菌阳...