基于奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿rAP1-BP-AP2重组蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立一种快速准确高效的检测奶牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿抗原相应抗体的检测方法,本研究以牛乳腺炎无乳链球菌Ia型PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、AP2及骨架蛋白BP 3基因串联表达的重组蛋白为ELISA包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立了奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体的间接ELISA检测方法。优化后抗原的最佳包被量为5.0μg/孔,血清样品最佳稀释倍数为1∶40,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶5 000。对S.agalactiae、S.pyogens、E.coli、S.aureus、S.epidermidis阳性血清进行检测结果显示,后4种阳性对照血清未出现阳性反应,表明该方法具有良好的特异性;对已知牛无乳链球菌阳性血清倍比稀释后进行检测时,当稀释倍数达到1:12 800时仍出现阳性结果,表明该方法具有较高的敏感度;重复性试验显示批内变异系数为2.41%~8.89%,批间试验变异系数为7.53%~10.46%;用该方法对426份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,结果显示,其样品阳性检出率为45.07%。本研究首次基于乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿三联重组蛋白建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种准确、可靠的检测方法。     

牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为测定牛源无乳链球菌表面免疫相关蛋白(sip)的抗原性,本实验通过建立间接ELISA方法,对该蛋白的抗原性进行分析及鉴定.根据无乳链球菌sip基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板,PCR扩增sip抗原表位优势区编码的基因序列,并将其与原核表达载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒pET-sip,转化宿主茵BL21中,经IPTG诱导,获得重组蛋白,western blot分析表明,重组蛋白具有良好的抗原性.以纯化的表达产物作为包被抗原,建立检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.125μg/mL,血清最佳稀释度为1:160,酶标二抗最适稀释度为1:4000.应用该方法对无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌兔阳性血清进行检测,结果表明,该方法具有良好的特异性和灵敏度.     

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌rSip-PGK-FbsA融合蛋白的间接ELISA检测方法的建立

为建立一种快速而准确的奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的无乳链球菌的膜表面相关蛋白SIP、磷酸甘油激酶PGK及纤连蛋白FbsA 3种串联表达的融合蛋白rSip-PGK-FbsA为包被抗原,建立了检测奶牛无乳链球菌抗体的间接ELISA方法。该方法与化脓性链球菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、金黄色葡萄球菌阳性血清、表皮葡萄球菌阳性血清均无交叉反应,特异性良好;阳性血清稀释至1颐12 800仍检测为阳性,具有较高的敏感性;批内和批间试验变异系数均小于10%,重复性好。利用该方法与以SIP、PGK单一蛋白建立的ELISA方法对160份已知样品进行检测,结果显示,该方法的阳性符合率达到98.6%,高于SIP、PGK单一蛋白建立的ELISA方法的阳性符合率。对389份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,其阳性检出率为46.53%。本研究建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种更加准确、可靠的血清学方法。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒DQ株gD基因表达及其间接ELISA方法的建立和初步应用

以原核表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白作为包被抗原,建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法.构建pET30a-gD重组质粒,在大肠杆菌中表达IBRV重组gD蛋白,Western-blot检测该重组蛋白具有良好的免疫活性.通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2.5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗最佳稀释倍数为1:5 000,与病毒中和试验,全病毒ELISA方法的检测结果符合率分别为87.5%、92.5%.用该法对黑龙江部分地区采集到的863份牛血清样品进行检测,结果阳性率为82.27%.本试验建立的间接ELISA方法可用于IBR的检测和流行病学调查.     

奶牛乳腺炎无乳链球菌sip与pgk双基因主要抗原区域的融合表达

为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk双重活性的融合蛋白,探讨其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性。根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk基因的核苷酸序列,设计合成4条引物,通过重叠PCR技术将2个基因主要抗原区域进行融合表达;在2个基因连接处引入45bp连接肽的核苷酸序列;重组蛋白通过pET30a(+)载体及BL21表达菌实现原核表达,表达的蛋白大小约为47 000;Western blot检测表明,重组蛋白可被无乳链球菌多抗识别,具有较好地免疫生物学活性。本研究为奶牛乳腺炎无乳链球菌亚单位疫苗的研发提供了一定的理论依据。     

TGEV S基因原核表达及表达蛋白间接ELISA方法的建立与初步应用

为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法，利用大肠杆菌表达系统成功表达E2蛋白并纯化，利用纯化后的蛋白作为包被抗原，用方阵法对影响ELISA试验的各个因素进行优化，并进行特异性、敏感性和重复性试验。确定E2抗原最佳包被浓度为1μg/mL,最佳血清稀释度为1∶40,最佳封闭液为1%明胶，最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min;最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD_450nm≥0.255。与血清中和试验和商品化试剂盒进行比较，总符合率分别为98%和96%,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与其它常见牛病毒阳性血清均无交叉反应。本研究成功建立了间接ELISA方法，为进一步用于大批量牛血清样本的抗体检测和流行病学研究奠定了基础。     

罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白的表达及IgM抗体间接ELISA方法的建立

为了建立一种具有良好特异性、敏感性、重复性和准确性的,能够检测罗非鱼源无乳链球菌的ELISA方法,试验首先进行了罗非鱼源无乳链球菌ScpB基因的克隆及其蛋白的表达和纯化,然后以重组蛋白作为包被抗原、罗非鱼待测血清作为一抗、抗罗非鱼IgM单克隆抗体2C10作为二抗、羊抗鼠IgG-HRP作为三抗建立间接ELISA方法并对该方法进行条件(抗原包被质量浓度、一抗稀释度、抗原包被条件、封闭液、一抗作用时间、二抗作用时间)优化,最后确定该方法的临界值并进行特异性、敏感性、重复性和符合性试验。结果表明：纯化后的罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白大小为104.6 ku,与预期大小一致,可被罗非鱼IgM抗体特异性识别;建立的IgM抗体间接ELISA方法的最佳抗原包被质量浓度为0.1μg/mL,最佳一抗稀释度为1∶5,最佳抗原包被条件为4℃、12 h,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳一抗作用时间为2 h,最佳二抗作用时间为0.5 h;临界值上限为0.456,临界值下限为0.377;批内变异系数为3.349%～5.272%,批间变异系数为2.793%～5.902%,均低于10.000%;仅可检测出罗非鱼无乳链球菌阳...     

非洲猪瘟病毒CD2v抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

为建立血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,研究真核表达ASFV CD2v重组蛋白,并以纯化的蛋白为包被抗原,通过反应条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原的最佳包被浓度为10μg/m L,待检血清的最佳稀释倍数为1∶25,最佳封闭液为1%BSA与明胶封闭缓冲液,酶标抗体最佳稀释度为1∶2 000,最优二抗稀释液为PBST,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.366。该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达1∶50,批内重复性和批间重复性变异系数分别为2.2%～9.4%和4.7%～8.1%。试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可初步应用于ASFV抗体检测。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

Effects of size of ingestively masticated fragments of plant tissues on kinetics of digestion of NDF

Ingestively masticated fragments were collected and sized via sieving. Different sizes of esophageal masticate and ruminal digesta fragments, and ground fragments of larger masticated pieces were incubated in vitro, and undigested NDF remaining at intervals of up to 168 h of incubation was determined. The ruminal age-dependent time delay (tau) for onset of digestion of NDF was positively correlated (P < 0.004) with the mean sieve aperture estimated to retain 50% of the fragments between successive sieve apertures (MRA). Degradation rate of potentially degradable NDF (PDF) and level of indigestible NDF were not related (P > 0.10) to MRA of masticated and ground fragments. Estimates of tau were positively related to MRA, with slopes of bermudagrass < corn silage < ruminal fragments of corn silage. It was concluded that fragment size-, and consequently, ruminal age-dependent onset of PDF degradation of a mixture of different fragment sizes results in an age-dependent rate of degradation of the more rapidly degrading of two subentities of PDF. Models are proposed that assume a tau before onset of simultaneous degradation of PDF from two pools characterized as having gamma-modeled age-dependency and age-constant rates. The ruminal age-dependent pool seems to be associated with the faster-degrading pool, and its rate parameter increases with range in MRA in the population of fragments. Conceptually, the ruminal age-dependent rate parameter for PDF degradation seems to represent a composite of several effects: 1) effects of the size-dependent tau; 2) range in MRA of the population of ingestively masticated fragments; and 3) subentities of PDF that degrade via more rapid age-dependent rates compared with subentities of PDF that degrade via age-constant rates. The estimated fractional rates of ruminative comminution of ingestively masticated fragments (0.060 to 0.075/h) were of a magnitude similar to the mean fractional rates of PDF digestion (0.030 to 0.085/h), which implies that ruminative comminution may be first-limiting to fractional rate of PDF digestion. The in vivo roles of ingestive and ruminative mastication of fragments on PDF degradation must be considered in any kinetic system for estimating PDF digestion in the rumen. These results and others in the literature suggest that the rate of surface area exposure rather than intrinsic chemical attributes of PDF may be first-limiting to degradation rate of PDF in vivo.     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

Mechanism of Action of Probiotic Function of Lactobacilli

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物.本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制.乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道.文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分(表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖)与肠道受体(C型凝集素受体、Toll样受体和Nod样受体),阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制.     

獭兔睾丸的组织学观察

家兔作为一种实验动物 ,推动了繁殖技术的发展。本试验通过对不同年龄公獭兔的睾丸进行组织学观察、测定 ,研究精子的发生规律 ,为系统地进行繁殖生理工作提供依据。1　材料与方法选 60日龄、75日龄、90日龄 3个年龄公獭兔各5只 ,用外科手术法摘取两侧睾丸 ,放入 Bouin氏液中固定 ,二甲苯透明 ,石蜡包埋 ,切成 5～ 8μm切片 ,H.E.染色。在显微镜下观察 ,并进行定量组织学指标测定及差异性比较。2　结果和讨论2 .1　睾丸定量组织学指标的测定结果　见表 1。表 1　獭兔睾丸定量组织学指标　　　μm,个 /精细管60日龄 75日龄 90日龄曲细精管…     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

Observations of fracture of the anconeal process of the ulna of swine

Fractures of the anconeal process of 5 pigs ranging in age from 4 to 8 months were studied radiographically and histologically. Clinically, animals with a fracture of the anconeal process had a "tight," restricted gait. In pigs at 4.5 months of age, a radiolucent line through the base of the anconeal process was composed of fibrocartilage, fibrous connective tissue, and hyaline cartilage. Subperiosteal proliferation of woven bone was located along the cranial surface of the olecranon, adjacent to the base of the anconeal process. In older animals, the radiolucent line through the anconeal process contained variable amounts of fibrous connective tissue and fibrocartilage. The proliferation of subperiosteal bone at the base of the anconeal process formed a "buttress callus" which retained a radiolucent area between the callus and the proximal surface of the anconeal process. The latter region of radiolucency was continuous with the transversely oriented line that traversed the base of the anconeal process.