体外受精生产性控犏牛胚胎条件的优化

为提高性控犏牛胚胎体外发育率,从性控精液的精子密度、受精时间、卵丘细胞的脱除程度、胚胎培养体系和胚胎培养环境各个环节进行优化。结果表明:(1)受精24h的卵裂率和囊胚率显著高于受精6h、18h(P0.05);(2)性控精液的精子密度0.4×10~6~0.6×10~6个/mL时的卵裂率显著低于4×10~6~6×10~6个/mL组(P0.05),但囊胚率差异不显著(P0.05),均显著高于性控精液0.04×10~6~0.06×10~6个/mL的卵裂率和囊胚率(P0.05);(3)卵丘细胞不脱除组的囊胚率(23.42%)显著高于半脱除组(13.77%)和完全脱除组的囊胚率(15.61%)(P0.05);(4)输卵管上皮细胞共培养的囊胚率(24.63%)和卵丘细胞共培养的囊胚率(23.42%)差异不显著(P0.05),但均显著高于FBS CR1aa培养液的囊胚率(P0.05);(5)性控犏牛早期胚胎在低氧培养环境下囊胚率(23.42%)显著高于高氧培养环境(11.83%)(P0.05),而孵化囊胚率差异不显著(P0.05)。结果说明,生产性控犏牛胚胎最佳的条件是性控精液的浓度0.4×10~6~0.6×10~6个/mL,受精时间为24h,采取卵丘细胞不脱除的方法,胚胎培养方式采用输卵管上皮细胞共培养的方式,胚胎培养环境采用低氧环境。     

不同因素对绵羊卵母细胞体外受精效果的影响

本试验研究了发情羊血清、不同个体的冷冻精液和新鲜精液、精子密度、受精时颗粒细胞的有无及不同培养液对绵羊体外受精效果的影响。结果表明,发情3d的血清与发情当天的血清相比,对卵裂率和囊胚率有极显著的影响(P0.01);不同个体的冷冻精子对卵裂率和囊胚率都有显著的影响(P0.05),但鲜精和冷冻精子的受精效果与个体有关;精子密度在2×106～6×106个/mL之间对受精效果没有影响(P0.05);颗粒细胞对受精的作用不明显(P0.05);不同的培养液对受精效果没有显著影响(P0.05)。因此,选用好的公羊个体精子,用发情3d的发情羊血清能显著提高受精效果。     

精卵共孵育时间等因素对绵羊卵母细胞体外发育的影响

本试验通过研究精卵作用时间、培养密度、气相环境对卵裂率和囊胚发育率的影响及早期发育快慢与胚胎发育能力的关系,得出:精卵共作用12 h和18 h,不影响囊胚率(P>0.05),但受精18 h的卵裂率明显高于受精12 h的卵裂率(P<0.05);对于四孔板而言,培养密度在50～80枚/孔之间,不影响胚胎后期发育率(P>0.05);早期用5%CO2,空气为平衡气,后期用5%CO2、5%O2,N2为平衡气的气相条件的卵裂率、囊胚率分别极显著高于单独使用这两种气相环境的囊胚率和卵裂率(P<0.01);早期发育较快的胚胎后期发育的能力更强(P<0.01)。     

牦牛卵母细胞的体外成熟、种间受精与胚胎培养

探讨了卵母细胞体外成熟时间、卵母细胞质量、精子准备和受精卵培养体系对牦牛卵母细胞种间体外受精效果的影响。结果表明:牦牛卵母细胞随体外成熟培养时间延长,第一极体排出率增加,囊胚发育率以成熟培养24 h最高;A级卵母细胞种间受精后囊胚的发育率(48.77±3.76)%显著高于B级(32.05±5.24)%和C级(7.54±7.18)%(P<0.05);BO液洗涤离心处理的精子受精后卵裂率(82.53±6.54)%显著高于Percoll液分离精子受精后的卵裂率(67.39±4.50)%(P<0.05),而两者囊胚率差异不显著((42.32±4.13)%vs(35.59±5.62)%,P>0.05);荷斯坦奶牛精子浓度在1×106～5×106/mL范围与牦牛卵母细胞受精效果差异不显著。卵丘细胞、输卵管上皮细胞共培养和SOF液培养种间受精卵,其卵裂率差异不显著,但共培养组的桑葚胚、囊胚和孵化胚发育率均显著高于SOF液培养组。     

不同处理方法对牛卵母细胞体外受精效果的影响

在牛体外受精(IVF)过程中,比较不同浓度的牛卵泡液对其卵母细胞的成熟效果,并将成熟的卵母细胞与不同方法获能的精子进行受精,分析其卵丘细胞在受精前后的脱除对卵裂率及囊胚率的影响。结果表明:添加10%的牛卵泡液(BFF)对卵母细胞的成熟有显著的提高作用(P0.05);卵丘细胞在受精后的脱除效果显著优于受精前的脱除(P0.05);上游法和离心法的精子获能方式对IVF没有显著差异,但离心法略优于上游法。     

精子不同处理和胰岛素不同浓度对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精的影响

探讨了分别使用新鲜、冷冻和超声波断尾精子以及在胚胎培养液中分别添加不同浓度胰岛素对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精(ICSI)胚胎早期发育的影响.结果:(1)使用冷冻解冻精子与新鲜精子相比对猪卵母细胞ICSI后的卵裂率和囊胚率均无显著影响(P＞0.05);2)精子断尾与否对猪卵母细胞ICSI后的分裂率和囊胚率没有显著影响(P＞0.05);3)在胚胎培养液中添加5 mg/L胰岛素与对照组相比可显著提高猪ICSI胚胎的囊胚发育率(18.22% vs 3.60%,P＜0.05).     

不同种公牛X／Y精子分离效果及对体外受精能力的影响

本研究首先时比了3头种公牛的X/Y精子分离效果,并通过常规冻精和性控冻精的活力检测,来评价流式细胞仪分离及冷冻处理对不同种公牛精子分离效果的影响.应用体外受精试验,探讨了不同种公牛个体的常规冻精和分离冻精的受精和胚胎发育能力.试验结果表明,不同种公牛个体间除分离准确率外,精子的分离速率(4.1×103/s vs 4.5×103/s vs5.3×103/s,P<0.05)和死精率(19.3%vs 14.5%vs 11.0%,P<0.05)都存在显著差异.三头种公牛的性控冻精在体外培养过程中,精子活力的下降速率要显著快于常规冷冻精液组.不同种公牛个体的分离冻精组在4小时的精子活力也有显著差异(1号种公牛9.1%vs 2号种公牛22.1%、3号种公牛21.5%,P<0.05).此外,常规冻精和性控冻精在受精后的卵裂率和囊胚率存在显著差异(1号种公牛:64.0%vs 41.6%,26.9%vs 19.3%;2号种公牛:67.3%vs 52.3%,29.2%vs26.5%;3号种公牛:60.3%vs 43.1%,27.3%vs 29.9%).上述结果表明,不同种公牛个体间精子的分离速率、死精率、以及对分离冷冻处理的耐受性存在显著差异,造成其解冻后活力和存活时间不同程度的下降;但在体外受精试验中,3头种公牛的分离精子仍具有正常的受精能力,并能支持胚胎发育到囊胚阶段.综上结果表明,选择适宜的种公牛和降低分离及冷冻处理对精子的损伤,对于提高精子的分离效率、分离精液的品质和体外受精效率都有着重要的意义.     

奶牛活体采卵-体外受精效率的影响因素研究

为建立稳定高效的活体采卵-体外受精技术体系,提高体外胚胎生产效率,本研究先利用屠宰场采集的新鲜卵巢卵母细胞进行体外受精,通过胚胎发育潜力来筛选最佳的体外胚胎培养液;再进一步研究不同种公牛精液和供卵母牛对活体采卵-体外受精效率的影响。结果显示,CR1aa培养液和mCR1aa培养液卵裂率差异不显著（P>0.05）,但mCR1aa组的囊胚发育率显著提高（28.1% vs 20.6%,P<0.05）;选取的3头荷斯坦种公牛精液的活体采卵-体外受精胚胎的卵裂率差异不显著（P>0.05）,但1号种公牛精液体外受精后囊胚率（38.7%）显著高于2号和3号（23.8%&22.9%）（P<0.05）;随机选择的3头活体采卵供体母牛（H1、H2、H3）获得的头均可用卵母细胞数无显著差异,但H1和H2供体母牛体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显著高于H3供体牛（P<0.05）,且H1供体牛体外受精囊胚率显著高于H2供体牛（P<0.05）。结果表明,mCR1aa培养液能显著提高体外受精囊胚发育率,适用于体外胚胎生产;种公牛精液和供体母牛个体差异会直接影响活体采卵-体外受精胚胎的生产效率,为奶牛活体采卵-体外受精生产技术体系的优化提供参考。     

奶牛X性控冻精体外受精应用研究

为了研究不同种公牛的常规冻精和分离冻精进行了体外受精试验,分别记录其原核形成率、卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数,旨在比较不同种公牛的分离冻精和常规冻精受精和胚胎发育能力上的差异。结果表明:3头种公牛的常规冻精和性控冻精在受精后的原核形成率和1号种公牛的卵裂率差异显著(P0.05),但囊胚率和囊胚细胞数均无显著差异(P0.05);且2号种公牛分离冻精的原核形成率和卵裂率显著高于1号种公牛(P0.05),与3号种公牛无显著性差异(P0.05)。     

猪精子及卵子质量对猪体外受精胚胎发育的影响

应用体外受精(in vitro fertilization, IVF)等生物技术可以缩短种猪培育时间,地方猪精液的冷冻保存可以解决保存和运输问题。通过对不同个体冷冻前后的精子质量、获能方式、卵子质量及多精受精率对IVF的影响进行了研究。结果显示:当精子活率从83.26%降至74.20%时,IVF的卵裂率、桑椹胚率显著下降(P0.05)。不同的获能方式对IVF胚胎的卵裂率无显著影响(P0.05)。3层(及以上)卵丘细胞的卵子IVF的卵裂率、桑椹率显著高于3层以下组(P0.05)。冷冻精子的IVF中,2-细胞、4-细胞和囊胚的发育能力显著低于新鲜精子(P0.05),受精后6～12 h的多精受精率也显著高于新鲜精子组(P0.05)。猪体外受精胚胎的发育能力受精子和卵母细胞的影响。无论使用新鲜精液还是冷冻精液的IVF胚胎,在桑椹胚期后的发育能力都会受到阻碍,多精受精可能是原因之一,但具体原因还需要更多的研究。     

换液培养对猪卵母细胞的成熟及胚胎体外发育的影响

通过后期去除激素培养比较了卵丘卵母细胞成熟及构建克隆胚后的发育情况,同时孤雌胚胎和体外受精胚胎体外培养48 h后全量换液,比较了其卵裂率和囊胚率之间的差异。结果显示,卵丘卵母细胞培养22h后换成不含激素的成熟培养液继续培养至44 h,其成熟率与对照组无显著差异(P0.05);后期克隆胚胎卵裂率和囊胚率与对照组均无显著差异(P0.05)。孤雌胚胎换液培养卵裂率高于未换液组,囊胚率低于未换液组,但差异均不显著(P0.05)。体外受精胚胎换液培养卵裂率以及囊胚率和未换液组差异不显著(P0.05)。本实验结果说明换液培养对卵母细胞的成熟及后续的体细胞克隆胚发育无显著影响,孤雌和体外受精胚胎换液培养对后期发育也无显著影响。     

牛孤雌生殖胚与体外受精胚体外发育比较

从卵巢采集的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)经体外成熟培养24 h后,随机分为2组分别用于孤雌激活与体外受精.在相同培养条件下,比较孤雌生殖胚与体外受精胚的发育率和发育速度.结果表明将牛孤雌生殖胚与体外受精胚分别置于mSOFaa和mBECMaa培养液中培养,卵裂率(89.3%vs.80.1%;83.2%vs.82.5%)、囊胚发育率(27.5%vs.24.0%;28.9%vs.21.9%)和孵化率(58.7%vs.56.7%;51.5%vs.53.3%),均无显著差异(P＞0.05);孤雌生殖胚与体外受精胚在体外发育的速度基本相同.对孤雌生殖胚胎进行培养可以代替体外受精胚胎筛选最佳体外培养系统.     

Leptin和ITS对牛卵母细胞体外培养和胚胎生产的影响

利用Leptin和ITS促进体外成熟和体外培养的牛卵母细胞的发育和质量,探讨提高胚胎体外生产的质量和数量的方法和技术。试验1：体外受精胚胎的培养液：添加BSA的KSOM中添加10mL/L浓度的ITS,结果使胚胎的桑椹胚率和囊胚率显著（P〈0.05）高于培养液中不加ITS的对照组（桑椹胚率：43.48%vs29.07%,囊胚率：22.83%vs11.63%）,卵裂率、正常分裂率和8细胞率与对照组差异不显著（P〉0.05）。试验2：在卵母细胞的体外成熟液中添加10μg/L具有生物学活性的重组鸡Leptin成熟肽融合蛋白,Leptin处理组和对照组卵母细胞经体外成熟、受精后转入加有10mL/LITS的KSOM培养液进行体外培养。试验组卵裂率和正常分裂率极显著（P〈0.01）高于对照组（88.96%vs66.81%和61.11%vs29.36%）,8细胞率显著（P〈0.05）高于对照组（84.84%vs69.57%）。Leptin处理的卵母细胞在受精后的桑椹胚率和囊胚率与对照组差异不显著,但最后的囊胚数量较对照组增加1倍多,分别为IVF卵母细胞总数的14.8%和6.4%（P〈0.01）。这说明,添加Leptin对牛卵母细胞体外成熟有促进作用,可显著提高卵母细胞受精后早期胚胎的卵裂率、正常分裂率和8细胞率;加入ITS则能提高桑椹胚率和囊胚率;而Leptin和ITS的按顺序结合使用,则能大大增加体外生产胚胎的桑椹胚和囊胚的数量,从而提高胚胎体外生产的效率。     

精卵因素对母牛卵胞质内精子显微注射效果的影响

实验探讨了精卵因素对母牛卵母细胞质内精子显微注射效果的影响.结果表明:新鲜精液组和性控冻精组ICSI对卵母细胞存活率、卵裂率和囊胚率均无显著差异(P>0.05);采用A、B、C级精子穿刺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级卵母细胞时,穿刺卵受精率、卵裂率和囊胚率在三者之间无显著差异(P>0.05),总体效果A>B>C、Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ;D级精子穿刺Ⅱ级卵母细胞后的穿刺卵受精率显著低于Ⅰ级卵母细胞(P<0.05),卵裂率和囊胚率与Ⅰ级卵母细胞相比无显著差异(P>0.05),穿刺Ⅲ级卵母细胞后的穿刺受精率和囊胚率均显著低于Ⅰ级卵母细胞(P<0.05),受精卵的卵裂率与Ⅰ级卵母细胞相比则无显著差异(P>0.05).由此可见:采用流式细胞仪分离的性控冻精与新鲜精液相比,对ICSI后的受精率和囊胚率无显著影响;精子活动力和卵子质量对ICSI的效果均有一定程度影响,且随精子活动力的降低和卵母细胞质量的下降而逐渐显著.     

不同受精方法对南阳牛卵母细胞体外受精的影响

本研究探讨了用直接离心法、上浮法和perco ll密度梯度离心法等3种方法处理精子对南阳牛体外受精效果的影响。结果表明3种方法处理的精子卵裂率差异不显著(84.2%vs84.5%vs83.6%),但是桑囊胚率perco ll密度梯度离心法和上浮法显著高于直接离心法(17.1%、16.9%vs13.8%)。同时比较了微滴法和微细管法对体外受精效果的影响,表明两种方法受精后的卵裂率差异不显著(84.1%vs81.1%),桑囊胚率微细管法显著高于微滴法(17.8%vs13.4%)。     

山羊卵母细胞体外成熟培养液体积筛选

研究在一定卵丘-卵母细胞复合体(COCs)与培养液体积比例条件下,不同体积的培养液对山羊卵母细胞体外成熟的影响。按照COCs 1枚/4μL培养液的比例,采用5种不同体积的培养液,即50,100,250,500和1 000μL,对山羊卵母细胞进行体外成熟培养和孤雌激活。结果:100μL和250μL两组的卵母细胞体外成熟培养24 h后,其卵母细胞成熟率分别为78.10%和74.62%,差异不显著(P>0.05),但高于50μL组(P<0.05)、500μL组(P<0.05)和1 000μL组(P<0.01)组。100μL组孤雌激活胚胎的卵裂率(68.37%)、桑葚胚率(48.78%)和囊胚率(27.61%)都优于其他各组,其卵裂率和囊胚率与250μL组相比差异不显著(P>0.05)。结果表明采用COCs 1枚/4μL培养液的比例条件下培养卵母细胞,宜选用100～250μL范围内的培养液体积进行卵母细胞成熟培养,其卵母细胞体外成熟率可以达到78.10%左右。     

输卵管和颗粒细胞单层对牛体外受精胚胎发育的影响

以屠宰场牛卵巢为试验材料,研究输卵管细胞单层(OCM)和颗粒细胞单层(GCM)对牛卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)后胚胎发育能力的影响。(1)从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs),并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3类:1级(≥4层);2级(2～3层);3级(0～1层)。作分别在IVM和IVC培养液中添加GCM(1×106个/mL)与不添加的对比试验。结果显示:添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率无明显影响(P>0.05);但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组(P<0.05)。(2)所有卵母细胞(包括COCs和裸卵)被随机分为3个组,在其IVM和IVC培养液中分别添加OCM、GCM或不添加体细胞(对照组)。结果显示:OCM和GCM组的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率均高于对照组(P<0.05),而两试验组之间差异不显著。     

不同因素对奶牛分离精子ICSI效率的影响

本研究旨在探讨不同的联合激活处理、精子预处理方法和单精子注射方式对奶牛分离精子ICSI效率的影响。借助显微操作仪将经不同预处理的奶牛分离X精子直接注入体外成熟22～24h的牛卵母细胞胞质内,注射过程采用回吸胞质和不回吸胞质2种处理,最后分别用3种激活方案对注射卵进行激活。结果表明:用CR1aa+Ionomycin+6-DMAP对ICSI注射卵进行激活后,卵裂率和囊胚率都高于A23187+CHX和7%ET+CHX两种联合激活组(63.74%vs61.09%、53.75%;28.54%vs17.68%、22.00%,P0.05);采用percoll密度梯度离心法处理精子,卵裂率(77.10%vs62.19%,P0.05)与囊胚率(26.95%vs22.82%,P0.05)均高于上游法处理组;ICSI时回吸胞质获得的注射卵,其卵裂率和囊胚率均显著高于不回吸胞质处理组(63.10%,25.35%vs41.56%,19.40%,P0.05)。结果表明,用percoll密度梯度离心法处理精子、注射时回吸胞质、用CR1aa+Iono-mycin+6-DMAP激活ICSI注射卵,可显著提高奶牛分离精子ICSI的效率。     

卵泡抑素对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎生长发育的影响

实验通过外源性添加不同浓度的卵泡抑素(FST),研究FST对牛卵母细胞体外成熟和受精卵体外发育的影响。结果表明:在以TCM199为基础培养液的卵母细胞培养体系中添加5、10、20 ng/mL FST对卵母细胞的成熟率无显著影响(P>0.05),但10 ng/mL FST可显著降低囊胚胎率7.5%、5.7%、4.6%(P<0.05)。在共培养体系下的胚胎培养液中添加10、20 ng/mL FST,受精卵的30 h卵裂率和囊胚率显著高于对照组(P<0.05);5、10、20 ng/mL的FST均可以显著提高受精卵的总卵裂率(P<0.05)。     

玻璃化冷冻牛卵母细胞单精子注射后体外发育能力的研究

实验研究了不同成熟培养时间的牛卵母细胞玻璃化冷冻及胞质内单精子注射(ICSI)后的受精效果。结果表明:成熟后的新鲜牛卵母细胞按照ICSI注射方法穿刺而不注射精子组与未经穿刺的对照组相比,孤雌激活后的卵裂率、囊胚发育率及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05);成熟培养16h(MⅠ)和23h(MⅡ)卵母细胞冷冻解冻后形态正常率均显著低于新鲜对照组(76.66%、87.33%vs100.0%)(P<0.05),冷冻解冻后二者分别成熟培养至24h,ICSI后胚胎的囊胚发育率(5.29%、14.41%)显著低于新鲜对照组(24.40%)(P<0.05);成熟培养23h与成熟培养16h的卵母细胞冷冻解冻后形态正常率及ICSI后囊胚发育率(14.41%vs5.29%)均有显著性差异(P<0.05)。实验证明,ICSI操作不会影响卵母细胞发育潜力;玻璃化冷冻影响卵母细胞解冻后形态正常率以及ICSI后胚胎的发育能力;成熟培养23h比16h的卵母细胞冷冻保存后经ICSI的胚胎发育潜力高。