桑树钙调素蛋白基因MCaM-3的克隆及序列分析与诱导表达

钙调素蛋白(calmodulin CaM)作为真核生物细胞内的多功能Ca2+结合蛋白,在调节植物的生长发育、环境适应性和抗逆性方面具有重要作用。利用桑树表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)克隆了一个编码桑树CaM基因的全长cDNA序列,命名为MCaM-3(GenBank登录号:GQ303247)。序列分析表明,MCaM-3全长951bp,存在143 bp的5′端非翻译序列(5′-UTR)和358 bp的3′端非翻译序列(3′-UTR),其开放读码框(ORF)长450bp,编码149个氨基酸,预测蛋白质分子质量为16.85 kD,等电点为3.95。用在线软件SMART分析显示,MCaM-3蛋白含有4个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+。同源分析表明,CaM基因在桑树与拟南芥、杨树、大豆、小麦、水稻、玉米各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种CaM基因的系统进化分析表明,桑树与蓖麻、烟草、大黄、樱桃的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,与正常生长环境相比,MCaM-3基因mRNA的转录水平在低温、干旱、盐胁迫条件下均显著提高,初步推测MCaM-3基因与桑树的抗逆性有一定关联。     

桑树光合系统Ⅰ psaE基因的克隆及表达分析

利用桑树(MorusL.)表达序列标签(EST),采用RT-PCR方法克隆了桑树光合系统Ⅰ(PSⅠ)psaE基因的全长cDNA序列,命名为MpsaE(GenBank登录号:GU645972)。序列分析表明,该基因序列全长705bp,存在97bp的5′端非翻译区和170bp的3′端非翻译区,其开放阅读框(ORF)长438bp,编码含有146个氨基酸的蛋白,预测蛋白分子质量为15.38kD,等电点为8.08。同源性分析表明,MpsaE编码蛋白与柑桔(Citrus sinensis)、毛果杨甙(Populus trichocarpa)和欧美杨(Populus eu-ramericana)psaE基因编码的蛋白具有较高的同源性,相似性达到98%。基于MpsaE与其它18个物种的psaE基因编码氨基酸序列构建的系统进化树显示,桑树与柑桔、蓖麻(Ricinus)、毛果杨甙和欧美杨的亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MpsaE基因mRNA在桑树不同组织及部位的转录水平有明显差异:在叶片中的转录水平较高,其中幼叶(刚展开的第1片叶)和中部叶片(8-10位叶)的转录水平最高,其次为上部叶片(2-3位叶)、顶芽和下部叶片;在根部的转录水平最低。初步推测MpsaE基因是桑树PSⅠ参与某些光合生理反应的一个亚基。     

柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析

采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。     

桑树转录因子CBF1基因的克隆及序列特征与低温应激表达

CBF(C-repeat binding factor)是一类与植物抗逆应答相关的转录因子。利用RT-PCR和RACE技术克隆桑树CBF1基因的全长cDNA序列,命名为MCBF1(GenBank登录号:JX186750)。该基因序列全长1 134 bp,包括693 bp的开放阅读框,87bp的5'端非翻译区和354 bp的3'端非翻译区;预测其编码的氨基酸序列具有保守的AP2结构域,且该结构域的两端拥有CBF家族特有的短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR,与其它植物CBF1的序列相似性较高;基于CBF1序列的系统进化树显示桑树与柑橘(Citrus jambhiri)、垂枝桦(Betula pendula)和切花月季(Rosa hybrid cultivar)的亲缘关系较近。将构建的pET28a-MCBF1原核表达载体转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MCBF1重组蛋白分子质量大小与预测值一致。半定量RT-PCR分析MCBF1基因在未经过低温处理的对照桑苗幼叶中无表达,而在低温处理后的桑苗幼叶中有表达,其中低温处理4 d后的表达量最高。克隆的MCBF1基因编码蛋白质具有典型的CBF家族结构域,并具有低温诱导表达的特点,推测其在桑树对低温的耐受性中发挥作用。     

蓖麻蚕核型多角体病毒p6.9基因的克隆及序列分析

基于丰富蓖麻蚕核型多角体病毒(Philosamia cynthia ricininucleopolyhedrovirus,PcrNPV)分子信息的目的,对PcrNPV DNA部分片段进行了测序分析,获得1个DNA结合蛋白基因p6.9的完整序列。该基因的读码框由240个核苷酸组成,编码79个氨基酸,分子质量约为9.8 kD,转录起始位点ATG侧翼序列符合Kozak规则,其上游34bp处具有晚期基因转录的保守起始序列taag,表明该基因为晚期表达基因。将PcrNPV与12种昆虫核型多角体病毒P6.9蛋白氨基酸序列作同源性比较的结果显示:PcrNPV P6.9蛋白氨基酸序列与家蚕(Bombyx mori)NPV P6.9的同源性为59%,与柞蚕(Antheraea pernyi)NPV的同源性为100%,表明PcrNPV与ApNPV的亲缘关系很近。     

野桑蚕肌球蛋白轻链2基因(MLC2)的克隆和序列分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了野桑蚕间接飞行肌(in-direct flight muscle,IFM)的肌球蛋白轻链2(myosin light chain2,MLC2)基因(GenBank登录号:EU332913),其cDNA序列全长979 bp,包括63 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)、603 bp的开放读码框(ORF)、终止密码子TAA和310bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR)。克隆该基因的内含子序列并分析基因结构表明,该基因包括3个外显子和2个内含子,编码201个氨基酸,预测蛋白质分子质量约22.0 kD,等电点4.67。用在线软件SMART分析显示,野桑蚕MLC2蛋白有2个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+,属于肌钙蛋白C超家族成员,并且含有保守的可以磷酸化的氨基酸残基,有可能具有磷酸化过程,参与肌动球蛋白ATPase活性的调节。     

羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析

采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。     

家蚕Bmtdh基因的克隆与序列分析

克隆了家蚕苏氨酸脱氢酶基因(Bmtdh),其cDNA长1 310 bp(No.ABA43639.1),包括227 bp 5′-UTR和1 026 bp的完整开放读码框(ORF)。Bmtdh在家蚕基因组上以单拷贝形式存在,编码342个氨基酸,其Ile29-Val322区域是一个完整的表面异构酶功能域。表达谱分析与EST数据的分析表明,Bmtdh在丝腺和卵巢中的转录水平高于其它组织,并且Bmtdh在家蚕4龄眠期、5龄早期的转录水平也很高,而在卵期(G2胚胎)和1龄早期没有检测到其转录表达,表明Bmtdh基因可能参与了蚕丝蛋白的合成过程。     

家蚕转录因子AP-4基因cDNA的分子克隆与生物信息学分析

AP-4(activator protein 4)是一种转录因子,在生物的生长发育中有重要作用。根据家蚕表达序列标签(EST)并利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了家蚕AP-4(Bombyx mori activator protein4)基因,结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,预测了AP-4蛋白的理化性质。获得的家蚕AP-4基因cDNA的全长为1621bp,其开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,基因由3个外显子和2个内含子组成。同源性比对表明该基因推导的氨基酸序列与棉铃虫AP-4和谷蛀虫AP-4推测的蛋白同源性分别为76%和54%,第45-99位氨基酸序列是一个典型的保守结构域。实时定量RT-PCR显示该基因在所检测家蚕的各发育时期中,除幼虫1龄和蛹期第4天无表达外,其它时期均有表达,其中幼虫3龄和4龄期的表达量较高。     

东方山羊豆肌醇-1-磷酸合酶基因的克隆与分析

探索新的基因和基因组合在植物耐盐性的研究中是至关重要的.本试验根据在不同植物中功能相同的同源基因保守序列设计引物,以250 mM NaCl胁迫后东方山羊豆(Galega. orientalis L.)幼嫩叶片中所提取的总RNA为模板,采用RT-PCR及RACE方法从东方山羊豆中克隆了一种新的肌醇-1-磷酸合成酶基因GoMIPS,cDNA全长1 858 bp,3'非编码区为256 bp, 5'非编码区为69 bp, 开放阅读框为1 533 bp,编码510个氨基酸.与已报道物种的MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,GoMIPS与其他植物MIPS基因氨基酸相似性高达87%～95%,GoMIPS推导的氨基酸序列中含有植物MIPS基因所具有典型的NAD+结合区(GWGGNNG)和底物结合位点(SYNHLGNNDG),且9种植物NAD+结合区位置比较保守,均起始于第68个氨基酸.这一结果暗示功能结构域在进化过程中具有较高的稳定性.     

家蚕Bmsps1基因的克隆和原核表达

从家蚕EST数据中检索到果蝇(D.melanogaster)硒磷酸合成酶基因(patuf)的氨基酸序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕sps1的cds,用PCR克隆家蚕sps1基因序列.家蚕sps1基因cDNA长1817bp(登录号:ABA43639.1).利用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为94%,与大肠杆菌序列同源性最差为46%.Bmsps1基因在家蚕基因组中是单拷贝的,只有一个外显子.推导3'UTR序列包含AATAA终止信号和Poly(A).同时我们对Bm sps1进行了原核表达研究.     

白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析

白颖苔草(Carex rigescens(Franch.)V.Krecz.)的热激转录因子基因是重要的耐热候选基因。通过序列多重比对设计简并引物,扩增出白颖苔草的热击转录因子基因cDNA的中间片断,并在此基础上利用RACE技术得到3′端cDNA片段和5′端cDNA片段。结果表明:通过序列拼接获得该基因的全长cDNA(1226bp),命名为CrHSF。序列分析表明其含有一个完整的开放阅读框(103～1023bp),编码蛋白质含有306个氨基酸,分子量为38.75kDa,等电点为5.85。CrHSF的氨基酸序列与OsHSF的同源性为59%,与已知的其他热激转录因子也具有较高的同源性。在CrHSF的氨基酸序列中没有预测到信号肽以及跨膜区域,但是具有多种翻译后修饰的加工位点。     

绵羊防御素(sBD-1)cDNA的克隆及其植物中表达载体的构建

为了获得在植物中表达的绵羊防御素 ,从绵羊舌表皮组织中分离提取总RNA ,经逆转录PCR (RT PCR)扩增出绵羊防御素sBD 1全长cDNA ,回收扩增产物连接到克隆载体 ,测序分析表明该cDNA为 2 1 5bp ,与报道序列完全一致。将该序列替换插入质粒PBI1 2 1中的GUS编码序列 ,构建植物表达载体PBIC 35SsBD1 ,为进一步进行转基因植物和绵羊防御素功能的研究奠定了基础。     

旋毛虫新生幼虫期特异性T668全长cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA片段 T6 6 8- SS2作为核酸探针 ,在新生幼虫 c DNA文库中筛选出 10个阳性克隆。序列测定及分子生物学软件分析表明 ,克隆 G10 - 6的 c DNA片段全长 16 0 0 bp,含 12 90 bp的开放阅读框架 ,编码 1个由 4 30个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量理论推导值为 4 6 84 0 ,等电点 (PI)为 9.6 5。主导氨基酸为Ser(11.39% )和 Thr(10 .93% )。开放阅读框架中具有丝氨酸蛋白酶保守功能区及酶活性位点结构 ,其 N末端的信号肽及 2个糖基化位点表明 ,其为分泌性糖蛋白 ,预示其可能在细胞外起着重要作用。DNA同源性分析表明 ,该 c DNA为一新的 c DNA分子。     

土耳其东毕吸虫原肌球蛋白基因的克隆

根据日本血吸虫原肌球蛋白cDNA序列和曼氏血吸虫的原肌球蛋白cDNA序列M27512的保守区设计引物，采用RT-PCR方法，成功克隆了土耳其东毕吸虫的原肌球蛋白全长cDNA序列。测序结果表明，TM序列全长1125bp，5’非翻译区为1bp～124bp，3’非翻译区为980bp～1125bp，开放阅读框为125bp～979bp，编码284个氨基酸。将该序列与其他血吸虫的序列进行同源性比较，结果与埃及血吸虫的TM同源性为90％，与曼氏血吸虫、日本血吸虫的TM同源性均为88％，该基因已经提交GenBank，序列号为》N560898。     

鲤鱼外周血白细胞TLR5M全长cDNA克隆及序列分析

本试验以鲤鱼TLR5M的EST序列为基础进行5'-RACE试验,获得了其cDNA的全长序列。结果表明,该序列共3182 bp,包含38 bp的5'端非编码区,486 bp的3'端非编码区,1个2658 bp的开放阅读框(ORF),共编码885个氨基酸。序列同源性比对结果表明,该序列与麦瑞加拉鲮鱼TLR5基因同源性高达84.46%。     

旋毛虫新生幼虫期特异性T314全长cDNA的克隆及表达

利用PCR将旋毛虫新生幼虫期特异性全长T314cDNA的信号肽祛作后重组到原核表达载体pET-28a。将重组质粒pET28-T314转入克隆菌DH5a和表达菌DE3，分别提取质粒进行酶切，测序鉴定。用KIPTG诱导培养重组表达菌DE3，做菌体裂解物外源表达产物的SDS－PAGE分析。将重组质粒表达的融合蛋白免疫家兔制备抗血清，采用Western blot检测T314cDNA在旋毛虫不同发育时期的表达情况及其天然表达产物的相对分子质量。测序结果显示：外源T314cDNA的PCR产物在重组质粒pET28-T314中阅读框架正确；SDS－PAGE分析结果显示：经IPTG诱导后转化菌DE3的裂解产物与对照菌相比出现了1条相对分子质量约为39000的新条带，大小与外源cDNA融合蛋白的理论推导值38800相符；Western blot检测结果显示：T314cDNA的天然表达产物仅存在旋毛虫新生幼虫，不存在于成虫与肌幼虫，且相对分子质量大小与其在原核重组质粒中表达产物相同。     

鲤鱼肿瘤坏死因子受体相关因子6全长cDNA克隆及序列分析

本试验以鲤鱼外周血白细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)EST序列为基础,经地高辛标记后作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从重组噬菌体中经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析结果显示,该序列包含有5'-非编码区(5'-UTR) 25 bp;3'-非编码区(3'-UTR) 535 bp,存在2个mRNA不稳定基序ATTTA;开放阅读框ORF长1632 bp,编码543个氨基酸。预测蛋白质等电点为5.88,分子质量大小为61.773 ku。序列同源性比对结果表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼TRAF6a基因同源性达99%。蛋白质序列分析结果发现,其具有TRAF家族的典型序列特征。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.