鸭BLVRA基因部分cDNA的克隆与序列分析

为研究胆绿素还原酶A(Biliverdin reductase A,BLVRA)基因的遗传分化,探索其结构和功能,根据鸡、人、小鼠、牛等动物BLVRA基因编码区的保守序列设计一对引物,以缙云麻鸭输卵管子宫部的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出鸭BLVRA基因的一段cDNA编码序列,并对其进行测序及序列分析。结果表明:该cDNA序列由634个核苷酸组成,编码211个氨基酸,分子量为24.1ku。与鸡、小鼠、牛、蟾蜍和人的核苷酸相似性分别为92.6%、64.9%、62.8%、69.0%、63.6%;氨基酸的相似性分别为96.2%、59.7%、60.7%、68.4%、59.7%,说明BLVRA基因在进化过程中较为保守。进一步的系统进化分析表明,鸭BLVRA基因与鸡的进化关系最近,蟾蜍次之,小鼠、牛和人较远,与传统的分类地位基本吻合。该基因部分cDNA序列的克隆,为获得BLVRA基因全长及其在各组织中的表达研究奠定了基础。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.     

应用RACE技术扩增鸭A-FABP基因及序列分析

为揭示鸭A-FABP基因的结构和功能,运用RACE方法克隆并鉴定了鸭A-FABP基因的全长cDNA序列。用1对含高度保守的DNA片段的兼并引物,从鸭腹部脂肪组织总RNA扩增部分A-FABP片段,测序结果与已知序列一致;根据已知的鸭A-FABP基因序列设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。经DNASTAR中的SeqMan软件拼接5′RACE产物和3′RACE产物以及已知序列而获得片段大小为652 bp的cDNA序列。该cDNA序列由64 bp的5′非编码区、399 bp的编码序列和189 bp的3′非编码区组成。鸭A-FABP基因399 bp的开放阅读框编码132个氨基酸。经Blastn和Blastx比对分析,鸭A-FABP基因的编码区核苷酸序列与人、猪、鸡和鹅分别有76%、78%、93%和93%的同源性。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。     

固始鸭白细胞介素-18全基因克隆与分子进化分析

根据GenBank发表的鸭IL-18cDNA基因序列设计、合成一对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如PHA等刺激脾淋巴细胞,直接提取脾淋巴细胞总RNA,扩增固始鸭IL-18基因,并克隆、测序。测序结果表明固始鸭IL-18基因全序列为610bp,包含1个完整阅读框,编码1条由200个氨基酸残基组成的多肽。序列分析发现,固始鸭IL-18基因与GenBank中两条鸭IL-18基因(AF336122和DQ490137)核苷酸同源性分别为98.8%、99.8%,与AF336122有5个碱基发生非同义变异,2个碱基为同义变异,氨基酸同源性为97.5%,与DQ490137有一个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为99.5%。固始鸭IL-18前体蛋白第30位谷氨酸处有一个IL-1β转换酶的caspase-1切割位点及在人和其他动物中已证实的IL-1标签序列,推测鸭IL-18成熟蛋白由170个氨基酸组成。固始鸭与人和其他动物的IL-18基因进化分析表明,IL-18基因存在着种的多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。     

鸭TLR2基因的克隆、序列分析及其结构预测

参考鸡Toll样受体2(TLR2)基因序列设计6对特异引物,采用PC R方法从鸭基因组中扩增得到鸭TLR2基因全序列。结果表明:克隆的鸭TLR2基因编码区全长2 382 bp,由1个开放阅读框组成,编码793个氨基酸,其中亮氨酸为14.2%,含有24个氨基酸的信号肽序列,属于I型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LR R)和Toll/IL-1R(TIR)同源区结构域;与鸡、人、猪、鼠和牛TLR2基因的同源性依次为80.0%、63.5%、61.4%、60.0%和58.4%,表明该基因是一个比较保守的基因。     

山羊MMP-9基因cDNA的克隆及生物信息学分析

为了克隆山羊基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的cDNA片段,分析其基因序列,试验于无菌条件下采集泌乳期奶山羊乳腺组织并提取总RNA。根据已知其他物种的MMP-9基因保守性区域设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增MMP-9基因的CDS区,测序后对核苷酸和推导的氨基酸序列进行分析,并对8个物种进行聚类分析。结果表明:得到长度为2 245 bp的MMP-9基因cD-NA片段(GenBank登录号为JQ670877),其中包含2 130 bp的CDS全长;核酸序列分析结果显示,该基因编码709个氨基酸,与人、小鼠和牛的核苷酸序列进行比对,相似性分别为84%、80%、96%,氨基酸相似性分别为79%、73%、94%。     

猪ICOS基因部分cDNA的克隆与序列分析

研究旨在对猪T细胞诱导型刺激物(ICOS)基因的cDNA序列进行克隆与分析。根据已报道的人ICOS基因cDNA序列设计引物,首次从猪脾脏组织总RNA中扩增出ICOS基因编码区全长cDNA序列,克隆于pMD18-T载体后进行测序并进行序列拼接,运用生物信息学分析DNA序列。结果表明:该基因编码区全长630bp,编码210个氨基酸,包含5个外显子。该序列与人全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为80%和85%;与狗和小鼠的推导氨基酸序列的同源性分别为81%和75%。这为进一步研究该基因的结构特点和功能奠定了良好基础。     

猪Cathepsin B 基因cDNA分子克隆、序列分析及遗传多态性分析

采用 RT-PCR 结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总 RNA 中克隆出了猪组织蛋白酶 B(Cathepsin B,CTSB)基因的 cDNA 序列,并推导出其编码的氨基酸序列.猪 CTSB 基因开放阅读框(ORF)全长1 008 bp,编码335 个氨基酸.同源性分析结果表明,猪与人、鼠、牛的 CTSB 基因 cDNA 编码区(CDS)同源性分别为 85%、81%、90%,推测的氨基酸序列同源性分别为 81%、79%、91%.利用同源性结合序列特征预测表明该蛋白具有信号肽和前肽序列.蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白具有木瓜蛋白酶家族的典型空间结构,包括1个底物结合凹槽和3个相互靠近的活性位点.另外采用 PCR-SSCP 方法,在147头个体中分析了CTSB基因第6内含子内的SS-CP位点多态性,检测到3个等位基因6种基因型.FF基因型个体的各项嫩度指标最高,其最大剪切力与硬度值分别为6.56 kg和23.55 kg·s,极显著地高于 EE 和 EF 基因型个体(P<0.01),平均剪切力为4.85 kg,显著地高于EF基因型个体(P<0.05).     

鸭CYP7_α1基因克隆、序列分析及组织表达研究

旨在克隆鸭胆固醇7α羟化酶1(CYP7α1)基因,并进一步探讨该基因的结构与功能,揭示其组织特异性表达规律。本研究以樱桃谷鸭为材料,运用同源序列克隆结合RACE技术,对鸭CYP7α1基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析及组织表达的研究。结果表明:鸭CYP7α1基因cDNA全长2 351bp,最大开放阅读框(ORF)1 539bp(114～1 652bp),共编码512个氨基酸;鸭CYP7α1氨基酸与鹅的同源性最高(97.5%),其次是鸡(92.8%)、人(67.3%)、猪(66.5%)、兔(65.7%)、大鼠(65.5%)、小鼠(65.5%)和牛(65.1%);经预测鸭CYP7α1蛋白可能含有1个P450超家族结构域;鸭CYP7α1基因在肝脏中呈高丰度表达,在其他9个组织中均未检测到或检测到少量表达,表明该基因的表达具有组织特异性。     

Molecular cloning of insulin-like growth factor-I complimentary DNA and promoter region in the domestic duck (Anas platyrhynchos)*

Complementary DNA (cDNA) and the flanking region of insulin‐like growth factor‐I (IGF‐I) of domesticated duck were cloned. The nucleotide sequence analysis of the cDNA showed seven and eight bases different, respectively, from chicken and turkey IGF‐I cDNA within the coding region. The amino acid sequence of prepro IGF‐I differed by one and two amino acids from those observed in chicken and turkey, respectively. However, no amino acid substitution was observed in the mature IGF‐I region. Sequence analysis of the promoter region and exon 1 of the duck IGF‐I revealed a high degree of similarity to that of the chicken IGF‐I gene. These results suggest that the mechanisms which regulate expression of the IGF‐I gene may be widely conserved in avian species.     

北京鸭β-catenin基因cDNA的克隆和生物信息学分析

试验探讨了北京鸭β-catenin基因的生物学功能,为进一步研究该基因对鸭皮肤毛囊的影响奠定基础。以北京鸭胚胎皮肤组织为材料,根据GenBank中发表的鸡、鹅等物种的β-catenin基因序列,设计并合成4对引物,采用RT-PCR方法,克隆北京鸭β-catenincDNA,并运用DNAMAN软件及在线工具对所得到的序列进行生物信息学分析。结果表明:北京鸭β-catenin基因cDNA长度为2996bp(Genbank登录号为FJ169885),包含由2346个碱基组成的编码区(CDs),有起始密码子ATG和终止密码子TAA,编码781个氨基酸;北京鸭β-catenin基因核苷酸序列与鸡、鹅、中华鳖、人和家猪相应区段(CDs)的同源性分别为95.06%、94.12%、90.11%、84.83%、84.31%;其氨基酸序列与鸡、鹅、中华鳖、猪、人的氨基酸同源性达99%以上,表明在进化关系上,β-catenin氨基酸序列有很高的保守性。     

鸭RIG-1基因的PCR扩增及其序列分析

维甲酸诱导基因1(RIG-1)是细胞质中侦测病原相关分子模式的识别受体。论文旨在扩增北京鸭RIG-1编码基因,并对其进行序列分析。通过PCR方法,从北京鸭脾脏中扩增得到RIG-1基因cDNA,并使用LaserGene分子生物学分析软件进行序列分析。结果发现北京鸭的RIG-1基因cDNA开放阅读框全长2 802bp,编码933个氨基酸。结构预测发现鸭RIG-1结构与哺乳动物类似,N端有两个串联CARD区,中间为DExD/H解旋酶区,C端为抑制区,各功能区起重要作用的氨基酸较为保守。同源性及进化树分析发现鸭RIG-1与鹅和斑马鱼的同源性最高分别为93.7%、78.4%,与哺乳动物同源性高于50%,与其他鱼类的同源性低于50%。成功扩增出北京鸭RIG-1基因cDNA编码序列,为鸭RIG-1的深入研究奠定了基础。     

番鸭脂肪酸合成酶基因的克隆及填饲对其mRNA水平的影响简

本研究以番鸭肝脏为试验材料,通过RT-PCR扩增出番鸭脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）部分CDS序列,利用相关分子生物学软件对其进行分析,同时采用实时荧光定量PCR技术检测FAS基因在成年番鸭各组织中的表达特性及填饲对番鸭肝脏和腹脂中该基因表达的影响。结果表明,克隆出的番鸭FAS基因CDS片段大小为1122 bp,编码374个氨基酸,与近缘物种禽类核苷酸同源性为92%～99%;实时荧光定量PCR结果表明,番鸭FAS基因在肝脏和腹脂中高表达,说明FAS具有组织表达特异性;填饲导致肝脏中FAS基因表达显著升高（P＜0.05）。本试验结果可为进一步研究FAS基因在番鸭肝脏脂质代谢中的作用奠定基础。     

Cloning of PRL and VIP cDNAs of the Java sparrow (Padda oryzivora)

Complementary DNA (cDNA) of prolactin (PRL) and vasoactive intestinal polypeptide (VIP) of the Java sparrow were cloned and sequenced. The proximal region of the PRL promoter was also identified. Java sparrow PRL was found to have 88.3, 88.3, and 89.1% sequence identity at the cDNA level to PRL of chicken, turkey, and duck, respectively. The predicted amino acid sequence had an overall similarity with a comparable region of chicken (91.4%), turkey (88.9%) and duck (92.0%) PRL. Based on the cDNA sequence and genomic structure of the chicken PRL gene, the proximal promoter was characterized. Sequence analysis of the proximal region of Java sparrow PRL promoter revealed a high degree of similarity to that of chicken, turkey and duck PRL promoters. Moreover, cDNA of prepro-VIP was also cloned and sequenced. Java sparrow prepro-VIP shows high similarity to chicken and turkey prepro-VIP. However, the region upstream of the 5' untranslated region of Java sparrow prepro-VIP did not show similarity to that of chicken. These results suggest that the mechanisms, which regulate expression of the VIP gene, may be different between precocial and altricial birds, but expression of the PRL gene may be widely conserved in avian species.     

鸭DCN基因编码区扩增、序列分析及其在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化

采用RT-PCR方法从鸭腿肌总RNA中扩增了鸭核心蛋白聚糖基因编码区序列,进行序列分析,并将编码鸭核心蛋白聚糖成熟蛋白的核酸片段连入原核表达载体pET-32a(+)中,加入IPTG诱导其表达后,亲和层析纯化表达的蛋白。采用SDS-PAGE检测,用质谱方法对表达的蛋白进行鉴定。研究成功克隆出鸭核心蛋白聚糖基因编码区序列,序列分析表明,鸭DCN编码区序列由1074个碱基组成,编码357个氨基酸,其中信号肽有16个氨基酸。将鸭DCN蛋白划分为9个结构域(LRR1-9),结合人DCN序列进行序列分析推测结构域中LRR4、5与TGF-β可能存在一定关系。SDS-PAGE检测和质谱鉴定结果表明获得了分子量为54.7ku的鸭DCN融合蛋白。     

鸭Ⅰ型禽副粘病毒YH99V株HN基因的克隆和序列分析

在浙江地区进行鸭病病因的调查过程中，从患病鸭群中分离到一株引起鸭产蛋锐减而不死亡的病毒，经鉴定该病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型，命名为YH99V株。以YH99V株的基因组RNA为模板，通过RT—PCR一步法扩增出其HN基因的cDNA片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，对其进行序列测定。测序后拼接出HN基因的序列长度为1785bp，该基因的ORF总长为1734bp，编码577个氨基酸。将YH99V株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现，它们的核苷酸序列同源性分别在82．1％～99．7％，氨基酸序列同源性为87．2％～99．5％。在同源性比较的基础上，进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病调查有着重要的意义。     

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的克隆及序列分析

本研究根据鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,利用PCR方法从已鉴定为2型鸭疫里默氏菌RA-FJ株的基因组DNA中扩增目的基因片段,胶回收PCR扩增片段,克隆到pMD18-T载体后进行序列测定.采用生物信息学软件对测序结果进行分析,结果表明所获得的RaDtxR基因编码完整的开放阅读框,全基因长度为654 bp,编码217个氨基酸.所编码的蛋白大小为24.82 ku,理论等电点为5.69,不稳定系数为38.45,属于稳定蛋白质类.将其与GenBank中已发表的RaDtxR基因序列进行核苷酸同源性比对分析,结果显示其与鸭疫里默氏菌疫苗株RA-CH-1株(GenBank登录号:CP003787)的核苷酸同源性为100.0%,与其他4株核苷酸同源性均为99.8%,仅在186位处存在无义突变.利用该基因对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的鸭大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌进行扩增,结果显示均未扩增到条带,对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的1型、2型、3型、11型和13型鸭疫里默氏菌均可扩增出特异性目的条带,表明RaDtxR基因可作为鸭疫里默氏菌鉴别诊断的靶基因.试验结果表明,本研究成功克隆到鸭疫里默氏菌RaDtxR基因,为研究其功能奠定基础.     

Cloning and sequence analysis of the complementary DNA for feline preproparathyroid hormone

OBJECTIVES: To clone and sequence the cDNA for feline preproparathyroid hormone (preproPTH) and to compare that sequence with other known parathyroid hormone (PTH) sequences. SAMPLE POPULATION: Parathyroid glands from 1 healthy cat. PROCEDURES: A cDNA library was constructed in lambda phage from feline parathyroid gland mRNA and screened with a radiolabeled canine PTH probe. Positive clones were sequenced, and nucleic acid and deduced amino acid sequences were analyzed and compared with known preproPTH and PTH sequences. RESULTS: Screening of approximately 2 X 10(5) recombinant plaques revealed 3 that hybridized with the canine PTH probe; 2 clones comprised the complete sequence for feline preproPTH. Feline preproPTH cDNA consisted of a 63-base pair (bp) 5'-untranslated region (UTR), a 348-bp coding region, and a 326-bp 3'-UTR. The coding region encoded a 115-amino acid peptide. Mature feline PTH consisted of 84 amino acids. Amino acid sequence analysis revealed that feline PTH was > 83% identical to canine, bovine, swine, equine, human, and macaque PTH and 69, 71, and 44% identical to mouse, rat, and chicken PTH, respectively. Within the region responsible for hormonal activity (amino acids 1 to 34), feline PTH was > 79% identical to other mammalian PTH sequences and 64% identical to the chicken sequence. CONCLUSIONS AND CLINICAL RELEVANCE: The amino acid sequence of PTH is conserved among mammalian species. Knowledge of the cDNA sequence for feline PTH may be useful to investigate disturbances of calcium metabolism and alterations in PTH expression in cats.