卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色.     

白背飞虱HSP90全长cDNA的克隆与特性分析

利用同源克隆及RACE的方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得热激蛋白HSP90基因的全长cDNA序列(Genbank登录号:JQ743628),该基因全长为2 707bp,包含421bp的3′非编码区域(UTR)和93bp的5′UTR,开放阅读框(ORF)为2 193bp,编码730个氨基酸。该基因预测的蛋白分子量为83.85kD,等电点为4.94,无信号肽、糖基化位点及跨膜结构。在N端具有HSP90基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列MEEVD。从进化分析结果看出,白背飞虱的HSP90与其它昆虫的HSP90蛋白的同源性较高,与褐飞虱相比较,同源性高达98%。HSP90基因的克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱的抗逆机理、耐受性及进化具有重要意义。     

马鹿生长素Ghrelin全长cDNA的克隆及序列分析

为获得马鹿(Cervus elaphus)Ghrelin全长cDNA序列并进行序列比较和分析,本试验以马鹿皱胃黏膜组织内提取的总RNA为模板,通过RT-PCR、RACE和基因克隆等技术进行克隆。结果表明:获得长度为539bp的马鹿cDNA全序列(GenBank accession no.KX857494),其中包括46bp的5′非编码区(5′UTR),351bp的开放阅读框(ORF),编码116个氨基酸残基的前原Ghrelin(preproghrelin),128bp的3′非编码区(3′UTR)和poly(A)14;Ghrelin的氨基酸同源性分析表明,马鹿Ghrelin cDNA全序列与驯鹿、梅花鹿、山羊、绵羊、牛等物种间的同源性较高,进化树分析与其亲缘关系远近一致。     

建鲤催乳素基因全长cDNA的克隆及序列分析和组织表达

为了解催乳素(prolactin,PRL)的基因序列以及在建鲤渗透调节组织中的表达情况,采用同源克隆和末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,RACE)的方法分离克隆了建鲤(Cyprinus carpiovar.Jian) PRL基因全长cDNA,得到1 028 bp的全长cDNA,包括633 bp的开放阅读框(ORF),51 bp 的5′末端非编码区(UTR)以及344 bp的3′末端非编码区(UTR)。对该基因序列和推测的氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示：建鲤与其它硬骨鱼类该基因的氨基酸序列相似度为55.02%~94.76%,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)相似度最高(94.76%),与齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)、斑马鱼(Danio rerio)相似度稍低,与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的相似度较低(55.02%),表明不同物种间PRL的氨基酸序列具有较高的保守性。用实时定量PCR (RT PCR)检测该基因在建鲤脑垂体、脑、肠、鳃、性腺、肝、脾、肾中PRL的相对表达量,其中脑垂体最高,其次是肝、鳃、脾、脑、肠、肾,在性腺中也有较低的表达量,表明脑垂体是建鲤PRL基因的主要表达场所,在性腺、肝、脾的表达说明其在鱼体内除了渗透调控可能还存在多种生理功能。     

鲢IGFB-1基因全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆鲢胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)基因,分析其编码蛋白的结构与功能,并分析低氧胁迫下该基因在鲢肝脏中的表达情况。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNAends,RACE)扩增鲢IGFBP-1基因的全长cDNA,通过半定量RT-PCR法对鲢肌肉、心脏、脑、肾脏、肝脏、腮和脾等组织器官IGFBP-1mRNA的表达水平进行检测,利用Real-time PCR法检测急性低氧胁迫0,2,4,6,8,10和12h后鲢肝脏组织中IGFBP-1表达量的变化。【结果】鲢IGFBP-1全长cDNA为1 081bp,具有73bp的5′非编码区(Un-translated Regions,UTR)、789bp的开放读码框(Open reading frame,ORF),以及219bp的3′UTR,编码含262个氨基酸的蛋白质。RT-PCR结果表明,IGFBP-1在肌肉、心脏、脑、肾脏、肝脏、腮和脾等7种组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,心脏和肌肉次之,在脑中的表达量最低;Real-time PCR结果表明,在低氧胁迫6h时,IGFBP-1cDNA在肝脏中的表达量显著增高,随后略有降低但仍显著高于未进行低氧胁迫处理组。【结论】克隆得到鲢IG-FBP-1全长cDNA,该基因在肝脏组织中大量表达;随着低氧胁迫时间的延长,鲢肝脏中IGFBP-1mRNA表达量升高,达最大值后继续低氧胁迫其表达量略有降低。     

SD-大白鼠催乳素受体基因的克隆与表达

应用RACE—PCR技术,克隆了全长2743bp的SD-大白鼠催乳素受体基因（gPRLR）cDNA。序列分析表明,cDNA含421bp 5′UTR、1357bp编码区和218bp3′U,UTR。比对奶牛催乳素受体基因并将前217bp看作第1外显子,则gem基因可划分为13个外显子。推导的蛋白序列含763个氨基酸,与奶牛、鸽及猪PRLR的同源性较高,其N末端含23个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含789个氨基酸。gPRLRmRNA在成年鼠睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达。     

卵形鲳鲹MyoG基因克隆及其胚胎组织表达分析

[目的]明确卵形鲳鲹胚胎发育中肌细胞生成素基因(MyoG)的表达规律,为阐明MyoG在卵形鲳鲹胚胎生长发育中的作用机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增卵形鲳鲹MyoG基因全长序列,通过ProtParam、GOR IV、SWISS-MODEL、TMHMM、SignalP、PSORT及NetNGlyc 1.0等在线软件对其进行生物信息学分析;运用实时荧光定量PCR检测MyoG基因在卵形鲳鲹不同胚胎发育时期(受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、胚胎形成期、眼囊期、耳囊期、心脏跳动期、晶体出现期和孵化期)的表达情况.[结果]从卵形鲳鲹胚胎组织中克隆获得的MyoG基因全长为1379 bp,编码233个氨基酸残基,其蛋白分子量为26059.19 Da,理论等电点(pI)为8.72;不稳定指数为75.23,即MyoG蛋白稳定性较差;总平均疏水指数(GRAVY)为-0.764,属于亲水性蛋白.卵形鲳鲹MyoG蛋白无跨膜结构,无信号肽序列,在第49位氨基酸处存在1个潜在的糖基化位点;卵形鲳鲹MyoG蛋白主要存在于细胞质和微体中,不属于分泌蛋白,其二级结构中以无规则卷曲占比最高(59.23%),其次为α-螺旋(21.46%)和延伸链(19.31%).MyoG基因相对表达量在卵形鲳鲹胚胎发育过程中呈明显的先升高后降低变化趋势.其中,在胚胎发育的前期(受精卵至胚体形成期)MyoG基因相对表达量极低,但从眼囊期开始其相对表达量迅速升高,至心脏跳动期达最高值;眼囊期、耳囊期和心脏跳动期3个时期的MyoG基因相对表达量均极显著高于胚胎发育前5个时期(P<0.01,下同);从晶体出现期开始,MyoG基因相对表达量极显著降低.[结论]MyoG基因除了在卵形鲳鲹眼囊期、耳囊期和心脏跳动期的分化形成过程中发挥重要作用外,在卵形鲳鲹胚胎器官分化形成后仍发挥着重要作用.     

长牡蛎钙调蛋白基因克隆及多态性分析

[目的]从钙调蛋白(CaM)基因克隆和序列分析入手,对长牡蛎CaM基因的功能进行深入研究,为生产实践提供参考依据.[方法]利用SMART RACE和EPIC-PCR技术克隆长牡蛎CaM基因,然后采用PCR-SSCP技术和DNA测序方法分析长牡蛎CaM基因编码区多态性.[结果]扩增获得长牡蛎CaM基因cDNA全长序列为917 bp,包括开放阅读框(ORF)全长450 bp,编码149个氨基酸;5′非编码区含222 bp,3′非编码区含245 bp; ORF内有3段内含子序列,分别为Intron-1:110 bp、Intron-2:137 bp和Intron-3:143 bp.PCR-SSCP分析获得C5引物野生型TT型、突变型GG型和杂合型GT型3种基因型.基因型和等位基因频率统计结果表明,GG型和G等位基因频率明显高于TT型和T等位基因;而最小二乘分析结果表明,CaM基因位于ORF内第158位T→G的SNPs位点,对长牡蛎的壳重有显著性影响(P<0.05),但对壳长、壳高、壳宽、体总重及肉重无显著影响.[结论]CaM基因对长牡蛎贝壳形成具有一定的影响作用.     

Cloning and polymorphism analysis of calmodulin (CaM) gene obtained from Crassostrea gigas

[目的]从钙调蛋白(CaM)基因克隆和序列分析入手,对长牡蛎CaM基因的功能进行深入研究,为生产实践提供参考依据.[方法]利用SMART RACE和EPIC-PCR技术克隆长牡蛎CaM基因,然后采用PCR-SSCP技术和DNA测序方法分析长牡蛎CaM基因编码区多态性.[结果]扩增获得长牡蛎CaM基因cDNA全长序列为917 bp,包括开放阅读框(ORF)全长450 bp,编码149个氨基酸;5′非编码区含222 bp,3′非编码区含245 bp; ORF内有3段内含子序列,分别为Intron-1:110 bp、Intron-2:137 bp和Intron-3:143 bp.PCR-SSCP分析获得C5引物野生型TT型、突变型GG型和杂合型GT型3种基因型.基因型和等位基因频率统计结果表明,GG型和G等位基因频率明显高于TT型和T等位基因;而最小二乘分析结果表明,CaM基因位于ORF内第158位T→G的SNPs位点,对长牡蛎的壳重有显著性影响(P＜0.05),但对壳长、壳高、壳宽、体总重及肉重无显著影响.[结论]CaM基因对长牡蛎贝壳形成具有一定的影响作用.