玻璃化冷冻水牛MⅡ期卵母细胞的初步研究

为建立玻璃化冷冻保存水牛MⅡ期卵母细胞的有效程序.试验比较了3种冷冻保护剂组合(Ⅰ:20%乙二醇 20%二甲基亚砜:Ⅱ:25%乙二醇 25%二甲基亚砜:Ⅲ:25%乙二醇 25%甘油)和3种玻璃化冷冻方法(毛细玻璃管法、铜环法及半麦管法)对水牛MⅡ期卵母细胞的毒性和冷冻效果的影响.结果表明,Ⅲ组的卵母细胞形态正常率显著低于I和Ⅱ组(P<0.05),且Ⅲ组的存活率也显著低于Ⅰ组(P<0.05).而Ⅰ和Ⅱ组的卵母细胞形态正常率和存活率没有显著差异(P＞0.05).进一步孤雌激活发现,Ⅰ组的卵裂率显著高于Ⅲ组(29.17±4.81%,5.56±11.11%,P<0.05),Ⅰ组的囊胚发育率显著高于Ⅱ和Ⅲ组(8.33士2.23%,2.43±2.87%,1.86±3.71%,P<0.05).然而Ⅱ和Ⅲ组间的卵裂率和囊胚发育率没有差别(P＞0.05).采用铜环法的回收率显著高于半麦管法(P＜0.05),但和毛细玻璃管法之间差异不显著(P＞05),冻后卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚发育率差异不显著(P>0.05).3种冷冻保护剂中Ⅰ组的细胞毒性作用最小.Ⅲ组的细胞毒性作用最大;铜环法和毛细玻璃管法能有效冷冻保存水牛的MⅡ期卵母细胞.     

抗冻剂对水牛卵母细胞冷冻后孤雌发育的影响

试验主要探索了不同抗冻剂组合对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻解冻后孤雌发育替力的影响.通过对3种抗冻剂组合(Ⅰ:20%乙二醇(EG)+20%二甲基亚砜(DMSO);Ⅱ:20%EG+20%1,2-丙二醇(PROH);Ⅲ:20%EG+20%PROH+10%DMSO)的毒性试验,发现试验组的形态正常率均低于对照组(p<0.05),但Ⅰ组的分裂率、8细胞率和囊胚率与对照组无显著差异(p>0.05).并以抗冻剂Ⅰ组做冷冻液,探讨了解冻液中蔗糖梯度浓度(A:0.5,0.25,0.10 mol/L与B:0.62,0.42,0.31 mol/L)对卵母细胞冷冻-解冻效果的影响.B组的形态正常率显著高于A组(p<0.05),且B组的分裂率和囊胚率与对照组无显著差异(p>0.05).最后比较了3种抗冻剂组合对卵母细胞冷冻解冻后的孤雌激活发育效果.3组的形态正常率、分裂率和8-细胞率之间无显著差异(p>0.05),但均显著低于对照组(p<0.05),其中Ⅰ组的囊胚率与Ⅱ、Ⅲ组及对照组差异均不显著(p>0.05),Ⅱ组和Ⅲ组的囊胚率显著低于对照组(p<0.05).结果表明:采用抗冻剂组合Ⅰ冷冻水牛MⅡ期卵母细胞,解冻时采用B组解冻液去除抗冻剂,可以取得较好的冷冻保存效果.     

绵羊成熟卵母细胞GMP玻璃化冷冻影响发育因素的研究

利用GMP法(毛细玻璃管法)冷冻成熟的绵羊卵母细胞,旨在探讨冷冻和解冻处理方法对绵羊成熟卵母细胞发育潜力的影响.对比在玻璃化冷冻液中添加0.3 mol/L蔗糖;卵母细胞冷冻前用7.5 μg/ml CB预处理;卵母细胞去掉颗粒细胞冷冻;以及四步法解冻和三步法解冻对卵母细胞形态完整率、孤雌激活胚发育率的影响.结果显示:玻璃化冷冻液中添加蔗糖孤雌激活卵裂率达到56.70%,极显著高于对照25.40%(P<0.01),桑葚胚率(16.49%)比对照(4.76%)有明显提高(P<0.05);冷冻前用CB进行预处理,解冻后形态正常率为78.78%,明显高于对照61.11%(P<0.05),孤雌激活卵裂率(39.39%)也高于对照组(21.11%);去掉颗粒细胞裸卵与保留颗粒细胞成熟卵母细胞解冻后形态正常率、孤雌激活卵裂率及桑葚胚率、囊胚率之间无显著性差异(P>0.05);四步法解冻和三步法解冻后卵母细胞形态恢复及孤雌激活后的发育率,两组之间差异不显著(P>0.05).在玻璃化冷冻液中添加蔗糖及卵母细胞冷冻前用CB预处理有利于卵母细胞冷冻解冻后形态恢复及孤雌激活后的胚胎发育.     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞体外发育能力的影响

采用猪未成熟(GV期)和体外成熟(MⅡ期)卵母细胞分组进行冷冻保护剂毒性试验,试验组经冷冻液处理,对照组不用冷冻液处理。结果表明,GV期与MⅡ期卵母细胞相比,两者经冷冻保护剂处理后,其存活率、体外受精胚卵裂率均无显著差异(P>0.05);试验组GV期卵母细胞存活率、体外成熟率及体外受精胚卵裂率虽略低于对照组(85.9%,72.4%和50.9%对91.3%,73.9%和53.3%),但差异不显著(P>0.05);试验组MⅡ期卵母细胞存活率虽显著低于对照组,但卵裂率与对照组无显著差异(P>0.05)。表明所用冷冻液及其处理程序,对卵母细胞无明显毒性。分3组对猪卵母细胞进行冷冻保存试验:I组为对照组;II组为GV期卵母细胞冷冻组;III组为MⅡ期卵母细胞冷冻组。结果表明,经开放式拉管(Open pulled straw,OPS)法玻璃化冷冻后,GV期和MⅡ期卵母细胞均获得较高的形态正常率,但GV期卵母细胞冷冻后存活率要显著高于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。经玻璃化冷冻后,GV期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均明显低于新鲜卵母细胞(42.6%和7.79%对73.9%和53.3%,P<0.05),MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后未获得卵裂。在GV期卵母细胞冷冻组,154枚卵母细胞冷冻后经体外成熟、体外受精及体外培养,共有12枚发生卵裂,其中6枚发育至8-细胞,3枚发育至16-细胞,3枚发育至桑椹胚。本研究表明,所用冷冻方案更适合于猪GV期卵母细胞的冷冻保存。     

猪冷冻精子的体外受精与单精子胞浆内注射

用猪冷冻精子进行体外受精和单精子胞浆内注射(ICSI),并研究添加L-半胱氨酸及不同成熟培养法对猪ICSI胚胎发育的影响。结果表明:用猪冷冻精子生产的ICSI胚胎卵裂率及囊胚发育率分别为68.3%和11.4%,均低于用冷冻精子进行体外受精(IVF)所获得的卵裂率和囊胚发育率(分别为76.9%和19.2%,P<0.05)。在培养液中添加1.71mmol·L~(-1) L-半胱氨酸培养3 h,无论是卵裂率、桑椹胚发育率,还是囊胚发育率,均未得到明显改善(P>0.05);采用含0.4%BSA的NCSU-23培养液进行猪卵母细胞成熟培养,ICSI胚胎卵裂率虽明显高,但各组所获胚胎发育率均无显著差异(P>0.05),表明所用卵母细胞的成熟方法并未对ICSI胚胎发育产生明显的影响;用颗粒细胞或卵丘细胞共培养ICSI胚胎后,卵裂率有明显提高(P<0.05),但各组囊胚发育率无统计学差异。     

玻璃化冷冻保存对体外成熟猪卵母细胞DNA的影响

采用乙二醇(EG) 二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂处理并使用微管法冷冻保存猪卵母细胞,运用细胞形态观察和单细胞凝胶电泳(SCGE)方法检测玻璃化冷冻过程对细胞DNA损伤情况.结果显示:保护剂处理冷冻组,细胞形态正常率和DNA异常率分别为63.364%、42.059%;同保护剂处理未冷冻对照组82.571%、25.758%的差异显著(P<0.05).表明冷冻保存过程对猪卵母细胞DNA有一定影响:以无冷冻保护剂处理卵母细胞为对照检测保护荆的细胞毒性,对照组形态正常率和DNA异常率分别为84.51%、12.28%,与冷冻保护剂处理组有显著差异(P,0.05).说明冷冻保护荆对猪卵母细胞DNA有明显细胞毒性作用.     

不同冷冻保护剂对小鼠原核期胚胎玻璃化冷冻的影响

研究不同冷冻保护剂对小鼠原核期胚胎玻璃化冷冻的影响。结果表明,15%乙二醇(EG)+15%1,2-丙二醇(PROH)+蔗糖与15%EG+15%二甲基亚砜(DMSO)+蔗糖相比,解冻后成活率分别为84.83%和95.83%,无显著差异(P0.05);卵裂率(60%、70%)显著低于对照组(92.5%)(P0.05),冷冻组间差异不显著(P0.05);PROH组囊胚率(33.84%)显著低于DMSO组与对照组(56.35%、76.90%)(P0.05);DMSO组囊胚细胞数与PROH、对照组差异显著(P0.05)。试验证明,在乙二醇中添加PROH的冷冻效果不及添加DMSO组,玻璃化冷冻影响原核期胚胎的后期发育。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化

为研究猪未成熟期(GV期)和体外成熟期(MⅡ期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化,随机取新鲜与冷冻-解冻后的GV期和MⅡ期卵母细胞制备电镜标本.GV期和MⅡ卵母细胞分3组进行处理:Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为GV期卵母细胞冷冻组,Ⅲ组为MⅡ期卵母细胞冷冻组.结果表明,所用玻璃化冷冻程序更适用于猪GV期卵母细胞的冷冻保存,GV期冷冻组卵母细胞的二乙酸荧光素(FDA)染色存活率、卵裂率均明显高于MⅡ期卵母细胞冷冻组.透射电镜观察结果发现,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,主要表现为部分卵丘-卵母细胞复合体(COC)发生卵丘细胞脱落,透明带破损,卵丘细胞碎裂,卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏,卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少,卵母细胞内脂滴多呈均质状.而MⅡ期卵母细胞冷冻后,皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下,仅可见形态不规则的不均质脂滴,其周围常严重空泡化.试验表明,采用适当的冷冻方案,可以获得少量源于冷冻保存的猪GV期卵母细胞的胚胎.而猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,经体外受精未见卵裂,脂滴严重空泡化是其最为明显的变化.     

卵巢质量及培养条件对郏县红牛卵泡卵母细胞体外成熟的影响

利用屠宰场采集的郏县红牛卵巢,研究卵巢质量及培养条件对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:A类卵巢平均获得的卵母细胞数(2.0枚)明显低于B类卵巢获得的卵母细胞数(5.4枚),从A类卵巢上获得的卵母细胞成熟率(55.00%)、卵裂率(37.50%)显著或极显著低于B类卵巢上获得的卵母细胞成熟率(80.00%)(p<0.05)、卵裂率(60.17%)(p<0.01);将随机分成三组的卵母细胞分别培养20h(Ⅰ组)、24h(Ⅱ组)、28h(Ⅲ组),三组成熟率(77.77%、78.57%、74.43%)之间无显著差异(p>0.05),但卵裂率Ⅰ组、Ⅱ组(51.79%、58.16%)明显高于Ⅲ组(36.98%)(p<0.05),Ⅰ组、Ⅱ组差异不显著(p>0.05);以M-199为基础液,比较单独添加ECS和FCS与激素配合的情况下,两种血清种类对卵母细胞成熟的影响,结果表明卵母细胞成熟率(73.33%、75.00%)、卵裂率(52.21%、54.35%)均无显著差异(p>0.05)。     

猪卵母细胞、胚胎玻璃化冷冻初步研究

本试验研究了不同冷冻承载工具,玻璃化溶液处理时间和不同发育阶段对猪卵母细胞超低温冷冻保存的影响。(1)比较凝胶上样管(gel-loadingtip;GLT)、开放式拉长麦管(openpulledstraw;OPS)、玻璃微细管(glassmicropipette;GMP)保存法对卵母细胞冷冻效果的影响。(2)比较在EFS40中处理30s,1min,2min对卵母细胞冷冻效果的影响。(3)比较MII期和GV期的卵母细胞冷冻效果。结果表明,(1)GLT法体外存活率为52.8%略优于OPS法(50.5%)和GMP法(51.1%)。(2)解冻后30s组和1min组的体外存活率分别为48.82%、43.9%,显著优于2min组的18.8%(p<0.05)。(3)解冻后MII期体外存活率为53.6%,显著优于GV期的22.0%(p<0.05)。(4)冷冻对猪卵母细胞的发育潜能影响较大,用新鲜精液进行体外受精,仅有4.9%的受精卵分裂,极显著低于对照组的49.5%(P<0.01);并且发育至4细胞期的比例为1.7%,未能发育至8细胞期。胚胎在25%VS1冷冻液中平衡20分钟后将胚胎在65%VS1冷冻液中平衡20秒,然后将胚胎再放入到100%VS1冷冻液中在30秒的时间内装入GLT管投入到液氮中进行保存。扩张囊胚的冷冻效果要明显优于孵化囊胚。     

猪未成熟卵母细胞玻璃化冷冻的研究

研究了乙二醇(EG)、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)和甘油(GLY)这4种渗透性冷冻保护剂及其两两组合对玻璃化冷冻未成熟(GV期)猪卵母细胞的影响;比较了3种不同冻前预处理方法和2种不同的解冻方法.结果表明:EG组卵母细胞所取得的成熟率为12.90%,与DMSO组(8.62%)及EG和DMSO混合组(9.61%)差异不显著(P＞0.05),但明显好于其他各组(P＜0.05);6步预处理法和3步预处理法所取得的卵母细胞存活率和成熟率显著高于1步预处理法(P＜0.05),成熟率分别为12.33%和11.11%;3步和4步解冻法取得的成熟率要显著好于1步解冻法,成熟率分别达12.70%、10.47%.     

水牛波形蛋白基因克隆及其表达分析

[目的]克隆水牛波形蛋白(VIM)基因,并明确VIM基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况,为研究VIM在卵母细胞成熟及附植前胚胎发育中的作用机理打下基础.[方法]根据GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列设计引物,采用RT-PCR克隆水牛VIM基因,利用在线软件程序对克隆获得的水牛VIM基因进行生物信息学分析,同时以细胞免疫荧光试验检测VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况.[结果]水牛VIM基因长度为1469 bp,其编码区长度1401 bp,编码466个氨基酸.水牛VIM基因序列与人类、黑猩猩、食蟹猴、家犬、马和牛的VIM基因序列具有高度的同源性,分别为93%、93%、93%、94%、94%和99%;基于VIM基因序列构建的系统发育进化树也显示水牛与牛的亲缘关系最近.水牛VIM的分子量为53.73 kD,理论等电点(pI)5.05,主要在线粒体中表达,稳定性差(不稳定系数53.65),具有较强的亲水性,无跨膜结构,不属于分泌型蛋白,其蛋白结构以α-螺旋为主.VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中均有表达,且在成熟卵母细胞中的表达量明显高于早期胚胎.[结论]水牛VIM基因编码序列具有较高的保守性,且在水牛成熟卵母细胞(MII期)中的表达量明显高于早期胚胎(2-细胞阶段).     

山羊卵母细胞冷冻保存技术研究

检测不同冷冻保护剂(PROH、DMSO、甘油)及不同冷冻方法(程序冷冻法、OPS玻璃化冷冻法)对山羊卵母细胞发育情况.结果表明,PROH(GV:85.3%;IVM:85.4%)和DMSO(GV:82.2%;IVM:85.2%)对各期卵母细胞的正常形态保护能力无显著性差异(P>0.05),但均显著高于甘油(GV:70.4%;IVM:75.5%)(P<0.05).以PROH作为冷冻保护剂,其GV期卵母细胞成熟率(27.2%)均显著高于DMSO(18.9%)和甘油(10.1%)(P<0.05);IVM卵母细胞受精率(25.6%)也显著高于DMSO(18.7%)和甘油(14.1%)(P<0.05).常规程序冷冻和OPS玻璃化冷冻法,GV期卵母细胞的成熟率分别为21.3%和29.9%,受精率分别为6.3%和9.1%;培养9 h卵母细胞的成熟率分别为20.5%和32.0%,受精率分别为5.1%和10.7%;IVM卵母细胞的受精率分别为21.4%和30.3%,2-细胞率分别为4.8%和10.5%;不论是常规程序冷冻还是OPS玻璃化冷冻,GV期和培养9 h卵母细胞的成熟率和受精率差异不显著(P>0.05),但受精率均低于IVM卵母细胞(P<0.05).结果显示,PROH作为山羊卵母细胞的冷冻保护剂,其保护作用明显优于DMSO及甘油;OPS玻璃化冷冻效果要明显优于常规程序法.     

猪卵母细胞冷冻保存研究

【目的】本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型，从而有效地保存猪卵母细胞;【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素（FDA）染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】（1）程序化法冷冻保存中，9%乙二醇（EG），10%二甲基亚砜（DMSO），10%甘油（Gly）均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用，极显著高于对照组（FDA染色成活率33.8%，25.8%，23.5% vs 2.5%，P <0.01），且以9%EG的效果最好，显著高于另外两组（ 33.8% vs 25.8%，23.5%, P <0.05）。（2）玻璃微细管（GMP）法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法，以普通的麦管（Straw）法进行的程序化冷冻为对照组，GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率（分别为63.3%和34.5%，P<0.05）。（3）在玻璃化冷冻方法中，不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液，Straw和GMP管作冷冻液载体，卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%，二者差异显著（P <0.05）。（4）用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著（成活率分别为30.0%和59.7%，P<0.05）。冷冻后继续培养，分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。（5）冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4.9%的受精卵分裂，极显著低于对照组的49.5%（P<0.01）；发育至4-细胞期的比例为1.7%，但未能发育至8-细胞期以上胚胎。【结论】选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞，为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。     

GMP玻璃化冷冻对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻损伤和体外发育能力的影响

将体外成熟(IVM)24h的水牛卵母细胞随机分成对照组、冷冻剂毒性试验组、GMP玻璃化冷冻组,研究玻璃微细管法(GMP)冷冻对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻损伤和体外受精后发育能力的影响。结果表明:冷冻剂毒性试验组的存活率显著高于GMP玻璃化冷冻组;在透明带消化时间上,冷冻剂毒性试验组和GMP玻璃化冷冻组显著高于对照组。在单精入卵率上,冷冻剂毒性试验组和GMP玻璃化冷冻组显著低于对照组;在无精子入卵率上,冷冻剂毒性试验组和GMP玻璃化冷冻组与对照组差异显著;而多精入卵率3组间差异不显著。卵母细胞冷冻后进行体外受精,3组之间的2-细胞率,8-细胞率和桑椹胚率差异均极显著。表明冷冻剂和GMP玻璃化冷冻均会引起水牛MⅡ期卵母细胞透明带硬化,降低精子穿透率和其体外受精的发育能力。     

奶牛体外生产胚胎玻璃化冷冻技术研究

利用乙二醇(EG)及二甲基亚砜(DMSO)作为主要冷冻保护剂,对牛体外生产囊胚进行了冷冻保存试验,探讨了不同冷冻剂组合、平衡时间、蔗糖浓度、冷冻方法对牛胚玻璃化冷冻的影响,结果显示:牛胚置于30%DMSO、15%DMSO 15%EG和30%EG等3种不同冷冻保护剂,其解冻后发育率分别为75.3%、81.8%及71.4%(P＞0.05),差异不显著;含有10%EG与10%DMSO冷冻保护剂平衡30 s、45 s及60 s,其解冻后发育率分别为54.5%、75%和44.4%,45 s显著较30 s及60 s者高(P＜0.05);以15%DMSO 15%EG冷冻保护剂中添加0.25、0.5及1.0 M的蔗糖浓度,其解冻后牛胚后续发育率分别为50%、75.0%及33.3%,蔗糖添加浓度为0.5 M者效果显著较佳(P＜0.05);利用GMP、MDS及Cryoloop3种不同冷冻方式进行冷冻,其解冻后发育率分别为66.7%、71.1%及80.0%,三者间并无显著差异(P＞0.05).     

水牛热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

【目的】克隆水牛热休克蛋白70基因（HSP70）并进行生物信息学分析,同时明确HSP70基因在水牛成熟卵母细胞（MII期）和2-细胞期胚胎中的表达情况,为研究HSP70在水牛卵母细胞成熟及着床前早期胚胎发育中的作用机理提供理论依据。【方法】根据NCBI已公布的水牛HSP70基因mRNA预测序列（MH814759.1）设计引物,通过RTPCR克隆水牛HSP70基因,运用DNAStar、MEGA 7.0、TMHMM 2.0及SignalP 4.1 Server等在线软件进行生物信息学分析;同时采用细胞免疫荧光分析HSP70在水牛成熟卵母细胞及2-细胞期胚胎中的表达情况。【结果】水牛HSP70基因编码区（CDS）长度为1926 bp,共编码641个氨基酸残基。克隆获得的水牛HSP70基因序列与NCBI已公布水牛HSP70基因mRNA预测序列（MH814759.1）的相似性高达97.7%;与牛、家犬、山羊、小鼠、绵羊和大鼠的HSP70基因序列具有较高的相似性,其中与牛的相似性高达99.1%。基于HSP70基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示,水牛与牛的亲缘关系最近。水牛HSP70分子量为70.27 kD,分子式为C₃₀₈₈H₄₉₆₇N_8670972S₁₅,理论等电点（pI）为5.67,不稳定系数为32.84,属于稳定蛋白;不存在跨膜结构及信号肽,主要定位于细胞质（60.9%）、细胞核（30.4%）及线粒体（8.7%）,其亲水性较强;水牛HSP70蛋白结构以α-螺旋和β-折叠为主。HSP70在水牛成熟卵母细胞及2-细胞期胚胎中均有表达,且主要集中在细胞质。【结论】水牛HSP70基因在进化过程中具有高度的保守性,在水牛成熟卵母细胞和着床前早期胚胎中均有表达,且主要集中在细胞质,属于结构型HSP70。     

猪卵巢组织玻璃化冷冻保存初步研究

为了建立一种有效的卵巢组织玻璃化冷冻方法,试验采用乙二醇(EG) 二甲基亚矾(DMSO)作为玻璃化冷冻保护剂,将猪卵巢组织经过不同浓度的平衡液中处理后进行玻璃化冷冻保存。结果表明,经过两步平衡冷冻组卵巢组织中的卵泡形态结构基本正常;提取卵巢组织细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测玻璃化冷冻卵巢组织细胞DNA损伤,各实验组与对照组的结果无显著差异。显示采用EG DMSO作为玻璃化冷冻保护剂、两步平衡玻璃化冷冻方法可用于猪卵巢组织的冷冻保存,该方法不造成卵巢组织细胞DNA的损伤。     

不同因素对小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体的影响

[目的]研究在不同条件下小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体的变化,为卵母细胞纺锤体的研究提供参考依据。[方法]在不同条件下处理小鼠MⅡ期卵母细胞,通过免疫细胞化学方法和激光共聚焦扫描显微镜观察其纺锤体变化。[结果]卵母细胞在25℃、20 min时纺锤体异常,25℃、30 min或4℃、10 min时纺锤体缺失;5、10、20和40μg/ml细胞松弛素B(CB)作用2 h未对纺锤体产生影响;卵母细胞在20μmol/L秋水仙素中作用1 h纺锤体异常,40μmol/L时作用1 h纺锤体缺失;在4%多聚甲醛中4℃条件下,卵母细胞纺锤体结构以固定时间为1~12 h效果较好。[结论]小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体对外界环境变化敏感,体外操作时控制外部环境是保持卵母细胞纺锤体正常生理功能的关键。     

Cell Ultrastructure of Kiwifruit (Actinidia chinensis) Shoot Tips During Cryopreservation

The changes in the cell ultrastructure of in vitro cultured shoot tips from dwarf genotype of kiwifruit (Actinidia chinensis Ganmi 5) during cryopreservation were investigated. Shoot tips were preserved in liquid nitrogen using vitrification, and the cell ultrastructure was examined using transmission electron microscopy (TEM). The regular ultrastructure of the cell wall, cell membrane and nucleus of shoot tips could be damaged during the freezing and thawing associated with preservation using liquid nitrogen. The cell plasmolysis was increased and freezing tolerance was improved after preculturing and dehydrating in a preservation and vitrification solution (PVS2 ) (30% glycerol (Gly)+ 15% ethylene glycol (EG)+ 15% dimethylsulfoxide (DMSO) + 0.4 mol L-1 sucrose). The structure of some cells with low degree of injury and reversible damage was similar to that of the control and they could undergo normal cell division and differentiation. Besides, they could recover automatically and regenerate after their reculture.